论文部分内容阅读
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，可催化酚类化合物和芳香胺的氧化。担子菌纲中的白腐菌是生产漆酶的一类重要的真菌。随着漆酶研究的深入，漆酶在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、秸秆生物降解、土壤生物修复和饲料工业等方面得到了越来越广泛的关注和应用。本论文以白腐菌T.pubescensMB89为漆酶生产菌，研究了发酵产漆酶以及酶的分离纯化的条件，游离漆酶和固定化漆酶的酶学性质，同时研究了漆酶对秸秆木素、氯酚化合物和染料的降解作用，得到如下结论：
⑴T.pubescensMB89漆酶的发酵生产
T.pubescensMB89发酵生产漆酶的最佳培养条件为：接种量6.0mL；碳源为20g/L葡萄糖，氮源为5.0g/L蛋白胨；pH5，25℃，110r/min振荡培养。发酵中期(10 d)添加1.0μmol/L的Cu2+能促进漆酶的分泌，黎芦醇、愈创木酚和苯甲醇对漆酶的分泌都具有诱导作用，其中苯甲醇的诱导效果最强。
⑵T.pubescensMB89漆酶的分离和纯化
80%硫酸铵沉淀可将90%左右的漆酶从发酵液中分离出来。漆酶粗酶液经过DEAE-Sepharose处理后，在280～610nm之间有两个漆酶主吸收峰，特征峰以峰1的构型为主。用SephadexG-100分离纯化峰1处得到的漆酶液后，所得的样品的比活力为20.5，活力回收率达到了6%，纯化倍数为16.7。
⑶T.pubescensMB89漆酶基本酶学性质
①是一种含糖量为13.3%的分泌型胞外糖蛋白酶,分子量约为60000Da，pI2.8。②最适催化温度为50℃，热稳定性较差。属于耐酸性酶，在偏酸性环境下的酶稳定性优于偏碱性环境中的稳定性。③作用底物广泛，底物为酚类化合物或者是含I-的非酚类化合物时，最适合pH范围为4.0～4.5。④NaN3是酶促反应的强抑制剂,浓度为0.1mmol/L的EDTA和1.0mmol/L的H2O2对漆酶有轻微的抑制作用。卤族离子对漆酶活性的抑制效果为F-＞Cl-＞Br-，Cl-和Br-对漆酶催化活性的抑制具有瞬时的特点。Cu2+、Co2+、K+、Ag+对漆酶酶活性有促进作用，Fe2+、Fe3+、Ca2+使漆酶的相对酶活下降，具有抑制作用，Na+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等离子对漆酶酶活性无显著影响。⑤以ABTS作为底物时，酶促反应的催化效率最高，达到48×106M-1·s-1，其次是丁香醛连氮，催化效率可达47×106，对具有羟基或甲氧基取代苯酚以及无机亚铁离子的底物，也具有较高的催化活性，对碘离子基本上没有催化活性。
⑷T.pubescensMB89漆酶固定化
固定化方法和最佳固定条件：①壳聚糖固定化漆酶(IE1)：戊二醛的最佳浓度为4%，最适交联时间为8h，最佳给酶量为1.5mg/g；②壳聚糖铜固定化(IE2)：CuSO4·5H2O的最佳添加量为0.6mg，最适络合时间为10h，最佳给酶量为0.25mg/g；③海藻酸钠/壳聚糖固定化(IE3)：2%海藻酸钠，2%CaCl2，1%戊二醛，1.5%壳聚糖。最佳给酶量1.5mg/g；④TEOB/PEG固定化(IE4)：最适PEG分子量为600～800，最佳使用浓度为1.5%，最佳给酶量为1.5mg/g。
IE1和IE4的最适温度均为60℃，IE2和IE3最适合温度为30℃。IE1、IE3和IE4的最适pH值均为4.5，IE2的最适pH为4。与Lac的最适pH值相比，IE的最适pH值均向碱性方向偏移。IE的酸碱稳定性、热稳定性和贮存稳定性都优于Lac。
⑸T.pubescensMB89漆酶对秸秆木素的降解
①玉米秸秆可以T.pubescensMB89发酵生产漆酶的碳源。漆酶对木素的降解作用明显优于对纤维素和半纤维素的降解。②秸秆分离木素经过漆酶处理后其聚合度和多分散性都降低。漆酶降解木素主要发生在高分子量木素部分。③漆酶处理使木素酚羟基含量增加，漆酶/ABTS体系使木素酚羟基含量降低。
⑹T.pubescensMB89漆酶对环境的生物修复
对氯酚化合物的降解：①Lac与DCP、TCP和PCP三种氯酚化合物反应4h，就可以使氯酚降解率达到50%左右；IE降解反应2h，降解率就已经超过50%。②在相同pH值条件下，IE和Lac对TCP的降解效率最高，其次是DCP，PCP的降解效果最差。Lac和IE降解DCP的最佳pH均为5.5,IE1的降解率最大为89.6%，Lac的降解率最小，为82.9%。TCP降解的最佳pH为5.5，IE1、IE3和IE4最大降解率均为92.4%，Lac与IE2的最大降解率接近89%左右。PCP降解结果表明Lac、IE2、IE3和IE4的最佳降解pH为5，IE1的最大降解率出现在pH5.5。③Lac对DCP、TCP和PCP降解的最适温度分别为35℃、45℃和45℃，PCP降解处理中，IE1和IE4的最适作用温度为45℃，IE2和IE3的最适温度为35℃。④Lac降解TCP、DCP和PCP的最佳活力为30U/mL。IE1降解DCP的添加量为40U/mL，降解TCP的添加量为20U/mL。IE2降解DCP、TCP和PCP的最适添加量为20U/mL，20U/mL和40U/mL。IE3和IE4降解三种氯酚化合物的最佳添加量分别为30U/mL，20U/mL和40U/mL。⑤随着DCP初始浓度的升高，其降解率逐渐降低，但变化趋势缓慢；DCP初始浓度为10mg/L时，降解率为100%；初始浓度低于10mg/L，降解率维持在100%的水平，初始浓度高于10mg/L时，降解率呈缓慢下降趋势。PCP的降解率随初始浓度升高而降低，5mg/L的降解率最高，达到37.8%，高浓度的PCP(20 mg/L)降解率仅为16.9%。IE在降解氯酚类化合物的时候，底物浓度对降解率的影响要小于对游离漆酶降解效果的影响。⑥在漆酶中添加5mmol/LABTS，可在反应30min内去除69%的PCP，而不加ABTS时，反应17h后只有24%的PCP被去除。固定化酶在有ABTS存在的环境下，对氯酚的降解作用于游离漆酶差异不大。
对染料的降解：①Lac和IE4对DB作用的最佳pH为4，IE1、IE2和IE3在pH5时对DB的降解率达到最大，在RRG的降解过程中，IE4的最大降解率出现在pH4，Lac和其他几种固定化酶的最适pH为5。Lac和IE对PCP的催化作用都随着pH的升高呈下降趋势，其中IE4对PCP的降解效果随着浓度的变化幅度最大。②IE对DB、RRG和IB的降解效果比Lac的降解效果好。Lac和IE对三种染料的降解率都随着温度的升高呈先上升后下降的趋势。IE3和Lac在40℃时对DB的降解效率最高，IE2在50℃时对RRG的降解率最大，IB最佳降解率出现在IE2，40℃的降解处理中。③随着酶活力的提高，DB、RRG和IB三种染料降解速率的变化趋势相同，即开始时增加显著，随后缓慢上升到逐渐趋于平稳，当酶活力为10U/mL时，三种染料的降解率均达60%。在DB降解过程中，同浓度的IE降解效果要好于Lac，IE1、IE4在浓度为5U/mL时，对DB脱色率就超过了50%。在RRG降解过程中，Lac和IE的作用无明显差异。IB的降解体系中，IE1和IE3在5U/mL浓度时，降解率就超过了50%。④染料降解速率随着染料浓度的增加而增加，Lac和IE反应体系中，染料浓度在0～10mg/mL范围时，反应速率快速增长，继续增加染料浓度，反应速率变化的幅度减小。IE1对三种染料的降解速率要大于Lac和其他三种IE的作用效果。⑤漆酶与染料在反应初期的10min，降解速率较快，Lac体系在反应20min后，降解率趋于稳定，IE体系则在反应40min后，降解率趋于稳定。因此，在Lac反应体系中，反应时间以不超过20min为宜。IE体系中，反应时间以40min为宜。⑥ABTS的添加对蒽醌类染料DB的降解率没有显著影响，在漆酶和偶氮类染料RRG以及靛青类染料IB反应体系中，ABTS的加入明显的提高了降解率，表明漆酶在降解RRG和IB两种染料的过程中，对于体系中的一些小分子物质具有依赖作用。
⑴T.pubescensMB89漆酶的发酵生产
T.pubescensMB89发酵生产漆酶的最佳培养条件为：接种量6.0mL；碳源为20g/L葡萄糖，氮源为5.0g/L蛋白胨；pH5，25℃，110r/min振荡培养。发酵中期(10 d)添加1.0μmol/L的Cu2+能促进漆酶的分泌，黎芦醇、愈创木酚和苯甲醇对漆酶的分泌都具有诱导作用，其中苯甲醇的诱导效果最强。
⑵T.pubescensMB89漆酶的分离和纯化
80%硫酸铵沉淀可将90%左右的漆酶从发酵液中分离出来。漆酶粗酶液经过DEAE-Sepharose处理后，在280～610nm之间有两个漆酶主吸收峰，特征峰以峰1的构型为主。用SephadexG-100分离纯化峰1处得到的漆酶液后，所得的样品的比活力为20.5，活力回收率达到了6%，纯化倍数为16.7。
⑶T.pubescensMB89漆酶基本酶学性质
①是一种含糖量为13.3%的分泌型胞外糖蛋白酶,分子量约为60000Da，pI2.8。②最适催化温度为50℃，热稳定性较差。属于耐酸性酶，在偏酸性环境下的酶稳定性优于偏碱性环境中的稳定性。③作用底物广泛，底物为酚类化合物或者是含I-的非酚类化合物时，最适合pH范围为4.0～4.5。④NaN3是酶促反应的强抑制剂,浓度为0.1mmol/L的EDTA和1.0mmol/L的H2O2对漆酶有轻微的抑制作用。卤族离子对漆酶活性的抑制效果为F-＞Cl-＞Br-，Cl-和Br-对漆酶催化活性的抑制具有瞬时的特点。Cu2+、Co2+、K+、Ag+对漆酶酶活性有促进作用，Fe2+、Fe3+、Ca2+使漆酶的相对酶活下降，具有抑制作用，Na+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等离子对漆酶酶活性无显著影响。⑤以ABTS作为底物时，酶促反应的催化效率最高，达到48×106M-1·s-1，其次是丁香醛连氮，催化效率可达47×106，对具有羟基或甲氧基取代苯酚以及无机亚铁离子的底物，也具有较高的催化活性，对碘离子基本上没有催化活性。
⑷T.pubescensMB89漆酶固定化
固定化方法和最佳固定条件：①壳聚糖固定化漆酶(IE1)：戊二醛的最佳浓度为4%，最适交联时间为8h，最佳给酶量为1.5mg/g；②壳聚糖铜固定化(IE2)：CuSO4·5H2O的最佳添加量为0.6mg，最适络合时间为10h，最佳给酶量为0.25mg/g；③海藻酸钠/壳聚糖固定化(IE3)：2%海藻酸钠，2%CaCl2，1%戊二醛，1.5%壳聚糖。最佳给酶量1.5mg/g；④TEOB/PEG固定化(IE4)：最适PEG分子量为600～800，最佳使用浓度为1.5%，最佳给酶量为1.5mg/g。
IE1和IE4的最适温度均为60℃，IE2和IE3最适合温度为30℃。IE1、IE3和IE4的最适pH值均为4.5，IE2的最适pH为4。与Lac的最适pH值相比，IE的最适pH值均向碱性方向偏移。IE的酸碱稳定性、热稳定性和贮存稳定性都优于Lac。
⑸T.pubescensMB89漆酶对秸秆木素的降解
①玉米秸秆可以T.pubescensMB89发酵生产漆酶的碳源。漆酶对木素的降解作用明显优于对纤维素和半纤维素的降解。②秸秆分离木素经过漆酶处理后其聚合度和多分散性都降低。漆酶降解木素主要发生在高分子量木素部分。③漆酶处理使木素酚羟基含量增加，漆酶/ABTS体系使木素酚羟基含量降低。
⑹T.pubescensMB89漆酶对环境的生物修复
对氯酚化合物的降解：①Lac与DCP、TCP和PCP三种氯酚化合物反应4h，就可以使氯酚降解率达到50%左右；IE降解反应2h，降解率就已经超过50%。②在相同pH值条件下，IE和Lac对TCP的降解效率最高，其次是DCP，PCP的降解效果最差。Lac和IE降解DCP的最佳pH均为5.5,IE1的降解率最大为89.6%，Lac的降解率最小，为82.9%。TCP降解的最佳pH为5.5，IE1、IE3和IE4最大降解率均为92.4%，Lac与IE2的最大降解率接近89%左右。PCP降解结果表明Lac、IE2、IE3和IE4的最佳降解pH为5，IE1的最大降解率出现在pH5.5。③Lac对DCP、TCP和PCP降解的最适温度分别为35℃、45℃和45℃，PCP降解处理中，IE1和IE4的最适作用温度为45℃，IE2和IE3的最适温度为35℃。④Lac降解TCP、DCP和PCP的最佳活力为30U/mL。IE1降解DCP的添加量为40U/mL，降解TCP的添加量为20U/mL。IE2降解DCP、TCP和PCP的最适添加量为20U/mL，20U/mL和40U/mL。IE3和IE4降解三种氯酚化合物的最佳添加量分别为30U/mL，20U/mL和40U/mL。⑤随着DCP初始浓度的升高，其降解率逐渐降低，但变化趋势缓慢；DCP初始浓度为10mg/L时，降解率为100%；初始浓度低于10mg/L，降解率维持在100%的水平，初始浓度高于10mg/L时，降解率呈缓慢下降趋势。PCP的降解率随初始浓度升高而降低，5mg/L的降解率最高，达到37.8%，高浓度的PCP(20 mg/L)降解率仅为16.9%。IE在降解氯酚类化合物的时候，底物浓度对降解率的影响要小于对游离漆酶降解效果的影响。⑥在漆酶中添加5mmol/LABTS，可在反应30min内去除69%的PCP，而不加ABTS时，反应17h后只有24%的PCP被去除。固定化酶在有ABTS存在的环境下，对氯酚的降解作用于游离漆酶差异不大。
对染料的降解：①Lac和IE4对DB作用的最佳pH为4，IE1、IE2和IE3在pH5时对DB的降解率达到最大，在RRG的降解过程中，IE4的最大降解率出现在pH4，Lac和其他几种固定化酶的最适pH为5。Lac和IE对PCP的催化作用都随着pH的升高呈下降趋势，其中IE4对PCP的降解效果随着浓度的变化幅度最大。②IE对DB、RRG和IB的降解效果比Lac的降解效果好。Lac和IE对三种染料的降解率都随着温度的升高呈先上升后下降的趋势。IE3和Lac在40℃时对DB的降解效率最高，IE2在50℃时对RRG的降解率最大，IB最佳降解率出现在IE2，40℃的降解处理中。③随着酶活力的提高，DB、RRG和IB三种染料降解速率的变化趋势相同，即开始时增加显著，随后缓慢上升到逐渐趋于平稳，当酶活力为10U/mL时，三种染料的降解率均达60%。在DB降解过程中，同浓度的IE降解效果要好于Lac，IE1、IE4在浓度为5U/mL时，对DB脱色率就超过了50%。在RRG降解过程中，Lac和IE的作用无明显差异。IB的降解体系中，IE1和IE3在5U/mL浓度时，降解率就超过了50%。④染料降解速率随着染料浓度的增加而增加，Lac和IE反应体系中，染料浓度在0～10mg/mL范围时，反应速率快速增长，继续增加染料浓度，反应速率变化的幅度减小。IE1对三种染料的降解速率要大于Lac和其他三种IE的作用效果。⑤漆酶与染料在反应初期的10min，降解速率较快，Lac体系在反应20min后，降解率趋于稳定，IE体系则在反应40min后，降解率趋于稳定。因此，在Lac反应体系中，反应时间以不超过20min为宜。IE体系中，反应时间以40min为宜。⑥ABTS的添加对蒽醌类染料DB的降解率没有显著影响，在漆酶和偶氮类染料RRG以及靛青类染料IB反应体系中，ABTS的加入明显的提高了降解率，表明漆酶在降解RRG和IB两种染料的过程中，对于体系中的一些小分子物质具有依赖作用。