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草菇（Volvariella volvacea）主要生长在热带和亚热带地区，是世界第六大食用菌品种。它是一种高温型担子菌，可以以稻草为基质生长，说明其具有高效完善的木质纤维降解酶系且具有良好的稳定性，这些酶可能成为工业化应用中极具潜力的新酶源。因此，对草菇纤维素酶和半纤维素酶的开发和特性研究具有重要的意义。木聚糖酶（EC3.2.1.8）是最重要的半纤维素降解酶之一，它以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键，产生不同链长的寡糖和木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。它广泛存在于各种微生物中，在饲料、造纸、食品、医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。根据本实验室构建的草菇cDNA削减文库中一条与木聚糖酶具有较高同源性的EST的序列信息，利用RACE技术克隆了相关的基因片段，获得了草菇木聚糖酶XynII的全长cDNA序列，并分析了该基因序列的有关信息。克隆的xynII的基因全长序列Genebank的登录号为KC492049。氨基酸序列比对发现该木聚糖酶包含一个糖苷水解酶家族10（GH10）的催化域，在序列的C-端和N-端分别包含一段独特的延伸序列：富含芳香族氨基酸的（W-R-W-F）和富含脯氨酸的（T-P-F-P-P-F），表明XynII是一种新的GH10的木聚糖酶。该酶与来源于Coprinopsis cinerea okayama7#130（Genebank登录号：XP001838887.1）的同源性最高，到达了68%。将XynII成熟肽的基因序列克隆至pPICZ B表达载体中，在毕赤酵母KM71H中进行诱导表达。该木聚糖酶最适温度为60℃，最适pH为7.0，在pH4.0-pH10.0的范围内都具有较好的稳定性。对榉木木聚糖，桦木木聚糖，可溶燕麦木聚糖和不溶燕麦木聚糖的比酶活分别为67.27U/mg，37.94U/mg，64.27U/mg和59.17U/mg。XynII对SDS具有极强的耐受性，在300mM的SDS条件下，其对桦木木聚糖，可溶燕麦木聚糖和榉木木聚糖还分别能保留101.98%，92.99%和69.84%的活性。该酶对蛋白酶K也具有一定的耐受性，在蛋白酶K和XynII1:50（w/w）混合的条件下37℃放置24小时，XynII没有明显降解。通过对XynII底物特异性分析发现，该酶是一种专一的内切型木聚糖酶，对纤维素底物没有活性。在寡糖降解能力方面，对木三糖（X3）具有较弱的催化能力，对大于三糖的木寡糖催化能力都较强。XynII和乙酰木聚糖酯酶（AEX1）在对去淀粉麸皮的降解中表现出一定的协同作用，在连续协同的作用方式下协同度最高达到了1.42。为进一步研究N-端和C-端延伸序列对XynII的结构和功能的影响，分别构建了N-端前10个氨基酸缺失的突变体XynIIΔN，C-端分别缺失4个，6个和7个氨基酸的突变体XynIIΔC4，XynIIΔC6，XynIIΔC7以及同时缺失N-端和C-端4个氨基酸的突变体XynIIΔNC4，并对它们的性质做了比较。除XynIIΔC7最适温度下降至55℃之外，其它突变体最适温度、pH都与原酶相同。在55℃下温度耐受性除XynIIΔC7之外，其它突变体都有不同程度的提高，其中，XynIIΔNC4半衰期达到了原酶的3倍。突变体对不同木聚糖底物的比酶活也较原酶有所提高，XynIIΔN，XynIIΔC4，XynIIΔC6，XynIIΔC7和XynIIΔNC4对榉木聚糖的比酶活较原酶分别提高了1.34，1.49，1.30，1.23和1.78倍。但对SDS的耐受性方面，突变体都较原酶有不同程度的下降。XynII在4%SDS中的半衰期为8.65小时，而XynIIΔN只有2.20小时，其它突变体均下降到了2小时以下。在对蛋白酶K的影响方面，除了突变体XynIIΔC7下降较多外，其余均无明显变化。另外，除XynIIΔC7以外，XynII其它突变体对X3的降解效率出现了不同程度的提高。其中，XynIIΔC4，XynIIΔC6以及XynIIΔNC4三种突变体的变化较为显著。而通过CD对结构的分析也揭示了不同突变体之间的差异性。由此说明N-，C-端序列的缺失改变了XynII的结构，进而影响了酶的催化特性。连续性是外切型纤维素酶典型的底物水解方式，然而在本研究中我们发现，来源于草菇的GH5家族的内切型纤维素酶EG1同样具有这样的特性。EG1降解滤纸（FP）的水解产物中可溶性还原糖与不溶性还原末端的比值在8小时和24小时分别为6.66和8.56。这一结果说明EG1是一种具有连续性水解方式的内切型纤维素酶。EG1是一种典型的GH5家族的糖苷水解酶，包含一个N-端的家族1的碳水化合物结合域（CBM）和一个家族5的催化活性域（CD）。为进一步揭示EG1连续性水解方式的分子机制，分别构建了在EG1的N-端和C-端添加一个CBM以及去掉CBM只保留催化活性域的三种突变体，比较了原酶及其突变体在静止和震荡两种不同条件下水解方式上的差异性。结果表明原酶及突变体对可溶和不溶性的纤维素底物表现出相同的水解模式，其主要水解产物均为纤维二糖（G2）。添加一个CBM的突变体对可溶与不溶性的纤维素底物在静止条件下的比酶活都有不同程度的下降。在静止条件下，CBM缺失的突变体水解的连续性明显下降，而添加了CBM的突变体在0.5小时内连续性也较原酶有明显的下降，但随着反应时间的延长（24h），突变体的连续性又逐渐接近原酶的水平。而在震荡的条件下，添加CBM突变体的连续性随着转速的增加（0-300rpm）表现出了明显的提高，而原酶在大于100rpm转速条件下连续性出现下降趋势。与此对应条件下突变体表现出解吸附能力的降低。由此揭示了EG1及其它连续性的内切型纤维素酶对底物的高吸附率和低解吸附率是其连续性水解方式的重要条件之一。