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研究目的:宫颈癌的发生率在女性常见恶性肿瘤中列第三位,尤其在发展中国家高发,严重威胁女性健康。已知宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV),尤其HPV16/18型的持续感染有关,而HR-HPV癌蛋白E6、E7通过不同的作用机制在宫颈癌的发生、发展中扮演重要角色。微小RNA(microRNA,miRNA)是长约20个核苷酸的非编码小RNA,可调控大量的目的基因mRNA,发挥生物学功能。研究证实,miRNA与多种肿瘤的发病机制有关,包括宫颈癌。近年来一些研究发现,人乳头瘤病毒(HPV)可以通过E6、E7癌蛋白影响细胞中miRNA的表达。因此,本研究的目的是探讨HPV感染与miRNA表达异常的关系,及其在宫颈癌发生、发展中的作用及作用机制。研究方法:1.构建HPV16E6、E7和E6/E7基因稳定转染的HPV阴性HT-3和C33A宫颈癌细胞系,采用miRNA表达谱芯片检测和筛选HPV16 E6/E7基因稳定转染前后差异表达的miRNA,采用qRT-PCR方法验证芯片筛选结果。2.选取HPV16 E6/E7转染后显著差异表达的miR-3156-3p作为候选miRNA,qRT-PCR方法分别检测miR-3156-3p在HPV阳性、阴性宫颈癌组织及正常宫颈上皮组织内的表达水平。3.在宫颈癌细胞系中瞬时转染miR-3156-3p的模拟物、抑制剂及相应阴性对照,以过表达或降调CaSki、SiHa和HeLa细胞中miR-3156-3p水平,利用CCK8细胞增殖实验、流式细胞凋亡实验、transwell小室迁移侵袭实验、matrigel血管形成实验在细胞水平进行功能实验。4.生物信息软件预测miR-3156-3p潜在的靶基因为SLC6A6,qRT-PCR和Western-blot方法分别检测miR-3156-3p过表达或降调的CaSki细胞和SiHa细胞中SLC6A6 mRNA和蛋白的表达情况,进一步采用双荧光素酶报告实验验证SLC6A6 mRNA3’非翻译区(3’UTR)是否存在miR-3156-3p的结合位点。5.qRT-PCR和免疫组织化学实验分别检测SLC6A6在宫颈癌组织和对照正常宫颈组织中mRNA和蛋白的表达水平。采用亚硫酸氢盐-基因组测序法(Bisulfite Genomic Sequencing,BGS)联合TA克隆测序检测HPV阳性、HPV阴性宫颈癌细胞系及正常宫颈组织与宫颈癌组织中SLC6A6基因启动子区的甲基化状态。结果:1.miRNA表达谱芯片筛选出6个差异表达miRNA(miR-3156-3p、miR-4779-3p、miR-4779-3p、miR-6841-3p、miR-454-5p和miR-656-5p),在HPV16E6/E7基因稳定转染的HT-3细胞中均较空载对照组表达降低。细胞系qRT-PCR实验结果证实miR-3156-3p在HPV16 E6、E7基因转染的HT-3和C33A细胞中较空载对照组表达降低,与芯片筛选结果一致。2.组织学qRT-PCR结果发现,miR-3156-3p在宫颈癌组织中表达较正常宫颈组织降低,且HPV16/18阳性宫颈癌组织较HPV阴性癌组织中miR-3156-3p表达显著降低。3.体外细胞功能实验验证,miR-3156-3p具有抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡,抑制肿瘤细胞迁移侵袭及血管形成的能力。4.Western-blot结果提示,蛋白水平miR-3156-3p可降调宫颈癌细胞中SLC6A6蛋白表达,但qRT-PCR结果显示,在mRNA水平miR-3156-3p的表达对SLC6A6mRNA无影响。双荧光素酶报告实验提示miR-3156-3p模拟物对SLC6A6野生型载体的报告荧光较对照组明显下调,而SLC6A6突变型载体中的报告荧光无明显变化。5.宫颈癌组织中SLC6A6 mRNA表达水平较正常宫颈组织升高,免疫组织化学染色检测发现宫颈癌组织中SLC6A6蛋白的表达水平在宫颈癌组织中明显高于正常宫颈组织。亚硫酸盐基因组测序法(BGS)结果提示SLC6A6启动子在HPV阳性与阴性宫颈癌细胞系、宫颈癌组织及正常宫颈上皮组织均呈低甲基化状态。结论:1.miR-3156-3p在宫颈癌中表达降低,可能与HR-HPV感染相关;2.miR-3156-3p可促进宫颈癌细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移、侵袭以及血管形成能力;3.miR-3156-3p可能通过从转录后水平负调控其靶基因SLC6A6蛋白表达,在宫颈癌中发挥抑癌作用。