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目的肝癌是一种威胁人类健康的恶性肿瘤。目前临床使用的抗肿瘤化学治疗药物均有不同程度的毒副作用且特异性低,有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使用的直接原因。其对人体中血液、淋巴组织细胞的伤害是导致人体免疫防御系统崩塌的最主要原因。因而实现肝癌早诊早治、有效防治和精准治疗是一项长期而艰巨的任务,同时寻找毒副作用小且疗效显著的抗肿瘤药物制剂也成为了药学工作者的一个长期的研究重点。醌类化合物丹参酮ⅡA是丹参脂溶性成分的代表(分子式:C19H18O3),其能够诱导细胞凋亡,具有广谱的抗癌活性。丹参酮ⅡA虽然毒副作用小,但几乎不溶于水且半衰期短的特性极大的限制了其在临床上的应用。如何采用适当的方法延长丹参酮ⅡA的作用时间并提高其靶向性,是其能够应用于抗肝癌治疗的关键。于是考虑将丹参酮ⅡA通过类脂囊泡包载以提高其生物利用度,改善其理化性质,增强其抗癌活性,增加其临床应用前景。为了使被类脂囊泡包载的丹参酮ⅡA具有更加优异的抗肝癌作用,我们希望它能够在肝部浓集,并在肿瘤细胞内充分释放,这就需要我们的囊泡更加“智能”一些,可以识别肝部位,并且对肿瘤细胞有特殊的“感知”能力。而成功的靶向制剂应具备定位浓集、控制释药、低毒以及可生物降解诸要素,类脂囊泡具有毒性小和可生物降解等关键属性,为了强化其定位浓集和控制释药的能力,考虑将类脂囊泡通过半乳糖修饰使其具有主动靶向性,并加入pH敏感辅料,控制药物在肿瘤部位的释放。方法本课题通过乙醇注入法制备丹参酮ⅡA靶向类脂囊泡,并进行了体内外药物效应动力学的研究。对该制剂的药物代谢动力学特征进行分析,最后通过组织分布的研究进一步验证其靶向性。一、采用乙醇注入法制备丹参酮ⅡA靶向类脂囊泡。以包封率为指标,对非离子表面活性剂用量、胆固醇用量等处方因素,以及搅拌速度、水合温度等工艺因素进行考察。最后通过正交试验确定了最佳的处方工艺。对制备的囊泡进行了质量评价,内容包括:形态学考察、粒径和电位的检查、包封率和渗漏率的检查等等。还建立了体外释放分析方法,验证囊泡的pH敏感性能。二、通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪研究肝癌细胞对靶向类脂囊泡的摄取,分析囊泡的体外靶向性,并根据靶向性研究结果,确定了半乳糖硬脂酸酯的用量。采用CCK8法检测肝癌细胞生存率,通过流式细胞仪检测细胞凋亡及周期,并对细胞内活性氧水平和线粒体膜电位进行检测以进一步验证丹参酮ⅡA及其制剂诱导细胞凋亡的作用。最后通过蛋白印迹法对丹参酮ⅡA靶向类脂囊泡促细胞凋亡作用机制进行研究。通过以上试验,对丹参酮ⅡA靶向类脂囊泡的体外药效进行充分的评价。三、采用高压尾静脉转染法建立Akt/c-Met诱导的肝癌小鼠模型,评价制剂的体内抗肝癌活性,并对其抗肝癌作用机制做进一步的研究。采用尾静脉注射给药的方式给药,眼眶取血的方法采集血样,对药动学参数进行测定分析。同样的给药方式,对药物在大鼠体内的组织分布进行研究,分析药物在体内的靶向性。结果一、根据最佳处方工艺并采用乙醇注入法制备的丹参酮ⅡA靶向类脂囊泡,其外观圆整光滑,分布均匀,粒径均值为53.72nm,zeta电位均值为-28.31m V,包封率均值为84.70%,60天后的渗漏率均值仅为3.43%。体外释放试验的结果显示,在碱性介质中,载药囊泡相对于游离药物都表现出了显著的缓释特征;弱酸性介质中,pH敏感囊泡的释放较普通囊泡稍快;酸性介质中,pH敏感囊泡的释放速度较碱性介质中快很多,释放更接近游离药物的释放过程,释放速度明显大于普通囊泡。二、分析显示,当用包载尼罗红的靶向类脂囊泡处理A2780卵巢癌细胞和HCT8结肠癌细胞时,细胞表现出极弱的荧光特征,而同样条件下处理肝癌细胞时则有较强的荧光特征。用游离尼罗红溶液和不同半乳糖硬脂酸酯用量的尼罗红靶向类脂囊泡处理Hep G2细胞和Huh7细胞时,随着半乳糖硬脂酸酯用量增加,细胞的荧光强度也随着增强,均大于游离尼罗红处理后的细胞的荧光强度。以IC50（50%Inhibiting concentration,μg/m L）作为抗肿瘤活性的指标,Hep G2和Huh7两种细胞中不同丹参酮ⅡA制剂的抗肿瘤活性遵循:Gal-pH-TanⅡA-NSVs（1.481,1.539）＞Gal-TanⅡA-NSVs（2.185,2.252）≈Free TanⅡA（2.256,2.505）＞pH-TanⅡA-NSVs（3.042,3.627）＞TanⅡA-NSVs（4.419,5.108）。细胞内活性氧水平和线粒体膜电位的检测结果以及流式细胞仪的分析结果都进一步说明半乳糖修饰pH敏感型丹参酮ⅡA类脂囊泡诱导细胞凋亡的作用最强。体内药效学的研究结果显示,半乳糖修饰pH敏感型丹参酮ⅡA类脂囊泡能够最大程度的抑制肝肿瘤的生长,对肿瘤病变区域的改善最为明显,这都有赖于其能够抑制与通路相关蛋白的磷酸化以及FASN的表达,从而阻断相关通路的信号传导,抑制肿瘤的发展。三、药动学试验结果显示,与游离药物相比,被类脂囊泡包载后的丹参酮ⅡA具有更长的血液循环时间,更大的曲线下面积（游离药物:8.81,普通囊泡:28.23,靶向囊泡:25.03,μg/m L·h）、更长的平均滞留时间（游离药物:3.53,普通囊泡:18.56,靶向囊泡:14.64,h）和半衰期（游离药物:3.09,普通囊泡:11.66,靶向囊泡:8.43,h）。与游离药物组比较,虽然靶向类脂囊泡组具有更长的平均滞留时间和更低的清除率,但其表观分布容积却更小。心、肝、脾、肺以及肾各组织器官中单位质量的丹参酮ⅡA含量的测定结果显示,游离丹参酮ⅡA在体内经历了较快的药物消除过程;通过类脂囊泡包载后的丹参酮ⅡA相对于游离丹参酮ⅡA在肝脏累积的趋势更明显;与此同时,半乳糖修饰后的靶向囊泡比普通囊泡表现出更显著的在肝脏累积的趋势。结论成功制备了半乳糖修饰pH敏感型丹参酮ⅡA类脂囊泡,其包封率在85%左右且渗漏率较低,粒径在50nm左右。相较于游离药物和普通类脂囊泡,其具有肝靶向性和在肿瘤部位快速释药的特点,在体内外表现出优异的抗肝癌活性。在体内,相较于游离药物,该制剂具有更大的药时曲线下面积、更长的体内平均滞留时间和半衰期,能够有效的延长丹参酮ⅡA在肝脏的驻留时间,显著增加丹参酮ⅡA在肝脏组织的分布。