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中药作为我国中医药瑰宝的重要组成部分,传统剂型是以丸、散、膏、丹为主,近年来在此基础上开发了多种新的剂型。其中,注射剂因其易吸收、起效快等特点,迅速打开了市场,并取得了良好的临床疗效。但是,随着中药注射剂(Traditional Chinese Medicine Injection,TCMI)使用的增加,中药注射剂不良反应事件也随之增多,受到业界的广泛关注。TCMI的不良反应多为Ⅰ型超敏反应或类过敏反应,都是肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放炎症介质所致。嗜碱性粒细胞是免疫反应的重要效应细胞,参与了天然免疫反应和获得性免疫反应,在免疫反应的起始和持续阶段都扮演了重要的角色。利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)的嗜碱性粒细胞活化实验(Basophil Activation Test,BAT),被认为是分析过敏原存在致敏性的有效手段。小鼠嗜碱性粒细胞尚无特异性表面标志,通过组合标记的方法可以鉴定外周血中的嗜碱性粒细胞。最近,有研究称CD200R可以作为小鼠嗜碱性粒细胞的活化标志。根据文献及嗜碱性粒细胞的性质本研究选择了三种表面标志,分别为CD200R、CD107a、CD69,分析其作为嗜碱性粒细胞活化标志的可行性。最终,本实验拟在小鼠BAT中,观察嗜碱性粒细胞表面活化分子的表达变化,分析TCMI是否存在致敏性潜能。1实验研究1.1小鼠外周血嗜碱性粒细胞鉴定取BALB/c小鼠外周血,抗-IgE-FITC/抗-CD4-PE/cy7/抗-CD45R B220-PE/cy7染色,流式细胞术分析,对IgE+/CD4-/CD45RB220-进行双色荧光强度检测,细胞比例为0.7%。提示该方法可以标记外周血中的嗜碱性粒细胞。1.2小鼠外周血嗜碱性粒细胞的活化将抗-IgE作为嗜碱性粒细胞的刺激剂,加入BALB/c小鼠外周血。孵育30min后,结合三色免疫荧光染色和流式细胞术检测嗜碱性粒细胞表面CD200R、CD107a、CD69的表达。结果显示CD200R、CD107a、CD69在抗-IgE刺激后表达皆显著升高提示这三种分子作为嗜碱性粒细胞的活化表型,用于进一步的实验研究中。1.3抗-IgE刺激小鼠外周血嗜碱性粒细胞的活化条件优化为选择较优的活化条件,针对表面标志表达的规律和特点,将刺激剂抗-IgE分为三种浓度及三个不同的刺激时间,利用流式细胞术分析嗜碱性粒细胞表面CD200R、 CD107a、CD69表达情况。最终确定了抗-IgE刺激嗜碱性粒细胞活化标志高表达的较优的时间-浓度组合分别为：CD200R在抗-IgE的刺激时间-浓度为30min-125ng/mL时表达明显；CD107a在抗-IgE的刺激时间-浓度为5min-125ng/mL时表达明显；CD69在抗-IgE的刺激时间-浓度为60min-125ng/mL时表达明显。1.4离子霉素、佛波酯及二者组合刺激小鼠外周血嗜碱性粒细胞的活化以离子霉素、佛波酯及二者组合分别作为刺激剂,针对不同的活化表型观察在三种不同刺激时间的作用下,CD200R、CD107a、CD69表达情况。实验结果显示：离子霉素刺激后活化表型表达升高不明显,佛波酯及离子霉素+佛波酯均可以刺激嗜碱性粒细胞表面CD200R、CD107a、CD69表达升高。1.5致敏小鼠嗜碱性粒细胞活化卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)腹腔注射免疫BALB/c小鼠,取致敏小鼠外周血,体外以PBS、抗-IgE及OVA刺激,利用FCM分析嗜碱性粒细胞中的CD200R、 CD107a、CD69表达情况。结果显示,致敏后体外刺激抗-IgE及OVA都可以使CD200R、CD107a、CD69表达升高,提示CD200R、CD107a、CD6可以作为特异性免疫反应引起的小鼠嗜碱性粒细胞活化。1.6TCMI刺激小鼠嗜碱性粒细胞活化表型变化获得正常BALB/c小鼠外周血,体外分别刺激PBS、抗-IgE或离子霉素+佛波酯及血塞通等9种中药注射剂,应用FCM对嗜碱性粒细胞表面CD200R、CD107a、CD69进行荧光强度检测。结果发现,抗-IgE或离子霉素+佛波酯组成的阳性组皆发生了CD200R、CD107a、CD69表达升高,TCMI各组中血塞通注射液使嗜碱性粒细胞表面CD200R表达升高,CD69也有升高趋势。1.7TCMI过敏性实验检测小鼠嗜碱性粒细胞活化表型变化将BALB/c小鼠按照组别两次腹腔注射鱼腥草等5种TCMI;一周后,获得全血,按照组别体外加入鱼腥草等5种TCMI进行激发,利用FCM分析各TCMI刺激后嗜碱性粒细胞表面的CD200R、CD107a、CD69表达情况。结果发现：双黄连注射液致敏后CD200R表达升高；清开灵注射液有使CD200R、CD107a、CD69表达上调的趋势。2结论利用流式细胞术结合双色免疫荧光染色技术,IgE+/CD4-/CD45R B220组合标记可以鉴定小鼠外周血嗜碱性粒细胞。CD200R、CD107a及CD69可以作为小鼠外周血嗜碱性粒细胞的活化标志。抗-IgE刺激小鼠嗜碱性粒细胞活化的较优条件为：在抗-IgE浓度为125ng/mL刺激30min时CD200R高表达；在抗-IgE浓度为125ng/mL刺激5min时CD107a高表达；在抗-IgE浓度为125ng/mL刺激60min时CD69高表达。通过非特异性免疫及特异性免疫引起的嗜碱性粒细胞活化,都可以使表面分子CD200R、CD107a及CD69表达升高。血塞通注射液直接刺激嗜碱性粒细胞有使活化标志CD200R、CD69表达升高的趋势,应进行深入的致类过敏性研究,以防类过敏发生。对5种TCMI过敏性反应流式细胞术分析,双黄连注射液存在使小鼠嗜碱性粒细胞表面CD200R表达升高现象,清开灵注射液有使CD200R、CD107a及CD69表达上调的趋势,应高度重视双黄连注射液及清开灵注射液的致敏性,以防过敏现象发生。