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松毛虫T4病毒(Dendrolimus punctatus tetravirus, DpTV)基因组RNA1中的含有一个开放阅读框,编码复制酶蛋白。序列分析表明,DpTV复制酶蛋白含有从N端到C端分别为甲基转移酶,解旋酶和RNA聚合酶的保守基序。通过同源比对,发现DpTV解旋酶为RNA解旋酶超家族Ⅰ中的成员,含有七个保守基序。目前为止,还没有关于T4病毒解旋酶蛋白的研究。在此文中,我们将对DpTV解旋酶结构域进行研究。首先我们根据已发表的DpTV核酸序列设计出特异性引物,以从DpTV中提取的基因组RNA为模板,进行RT-PCR,得到包含DpTV解旋酶结构域的cDNA片段,然后将该片段克隆到pET-32a表达载体中,转化到Rosetta (DE3) pLysS表达菌株中进行诱导表达。表达产物经过尿素溶解以及Ni-NTA亲和层析等方法进行分离纯化。用获得的重组蛋白对家兔进行注射免疫,得到特异性的抗DpTV解旋酶的多克隆抗体。由于在大肠杆菌原核表达系统中表达的DpTV解旋酶蛋白或以包涵体形式存在,或无生物活性,因此,为了获得可溶性的具有生物活性的DpTV解旋酶蛋白,我们采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统,将DpTV解旋酶蛋白在Sf9昆虫细胞中进行表达,并利用Amylose resin进行亲和纯化,结果获得了N末端带有MBP标签的可溶性DpTV解旋酶蛋白(MBP-Hel)。同时,为了研究保守基序对解旋酶蛋白活性的重要性,我们通过定点诱变,分别在MBP-Hel的motif Ⅰ、Ⅱ以及Ⅵ中引入点突变,构建出三个突变体蛋白即MBP-Hel(K606E)、MBP-Hel(DE670AA)以及MBP-Hel(TR830AA)。NTP酶活性研究表明,当体系中不加入核酸时,MBP-Hel具有ATP酶活性,三种突变体蛋白丧失该活性；当体系中加入dsRNA或ssRNA时,MBP-Hel的ATP酶活性被刺激增强,三种突变体蛋白也恢复了部分ATP酶活性；当体系中加入dsDNA或ssDNA时,MBP-Hel的ATP酶活性不受影响,三种突变体蛋白无NTP酶活性。该结果说明DpTV解旋酶蛋白保守基序中的保守氨基酸位点对于保持其NTP酶活性是非常重要的。最后,我们研究了MBP-Hel对各种NTP和dNTP的水解效率,按照从高到低依次排列为：dTTP> CTP> UTP> dGTP> ATP> GTP> dATP>dCTP。解旋酶利用NTP水解释放的能量,按照一定的方向沿着核酸链移动,将双链核酸之间的氢键打开,使双链解开成单链状态。对于DpTV解旋酶蛋白,在其发挥作用的过程中,必须先与核酸结合才能进行解旋。核酸结合研究结果显示：DpTV MBP-Hel蛋白及其突变体蛋白均能以不依赖ATP的方式结合dsRNA、dsDNA与ssDNA,突变导致蛋白对dsDNA与ssDNA的结合能力变弱,但DpTV MBP-Hel蛋白及其突变体蛋白对dsRNA具有相同的亲和力；DpTV MBP-Hel以依赖ATP的方式结合ssRNA,而突变体蛋白则不结合ssRNA。DpTV MBP-Hel具有dsRNA解旋活性,解旋方向为5’到3’方向,突变体蛋白保留有较弱的解旋能力；DpTV MBP-Hel有效的解旋dsRNA需要核酸底物5’突出3个以上核苷酸；DpTV MBP-Hel除了能解旋dsRNA以外,还能解旋模板链为RNA链的RNA与DNA的杂交链；各种NTP对DpTV MBP-Hel解旋活性的支持程度按照从高到低的顺序依次排列为：GTP> dGTP> dCTP> ATP> dATP> dTTP=CTP> UTP。综上所述,DpTV MBP-Hel是一个功能性的解旋酶蛋白,该蛋白在某些方面与其他RNA病毒的解旋酶蛋白相似,但是也存在着一些自身所特有的特性。在我们研究的基础之上,我们还需要在结构上以及该蛋白与病毒和宿主其他因子相互作用方面对其进行进一步的研究,这样才能更加全面的了解DpTV解旋酶蛋白的生物特性,从而更进一步的研究DpTV的复制机理。