Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1菌株在低氧条件下细胞生理特点及异化型反硝化途径调控特征分析

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趋磁细菌只能在低氧条件下大量吸收铁并在胞内合成纳米磁小体。本研究以趋磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1为材料,首先采用转录组学方法,寻找不同溶氧条件供试菌株细胞代谢的显著差异,随后重点探讨了 MGMSRv22046蛋白与细胞生长、磁小体合成的关系及其在低氧条件下启动和调控异化型反硝化途径的特征。通过严格控制自动发酵罐相对溶氧可使MSR-1合成与不合成磁小体。本实验首先在7.5 L发酵罐分别控制相对溶氧为0.5%及30.0%培养MSR-1细胞,获得合成与不合成磁小体的细胞并进行转录组测序。经两种细胞转录组数据分析获知,低氧条件下细胞中分别有77个基因转录上调,95个基因转录下调,这些差异表达基因包括与细胞氧、氮、铁代谢途径相关基因及未知功能基因。进一步对差异表达基因深度分析,揭示MSR-1在低氧磁小体合成条件下细胞生理特征,即:异化型反硝化途径被显著激活,可作为磁小体合成所需能量的补充;营养物质转运及基本代谢能力降低,而碳源、氨基酸转运系统dct、liv操纵元的多拷贝可弥补这一不足;两种细胞中磁小体岛mam/mms基因转录无差异,它们不受氧浓度调控,其编码蛋白可能为组成型表达。通过分析172个差异基因上游启动子区调控因子结合位点,绘制出细胞感受不同溶氧、控制代谢平衡的复杂的调控网络。发现可能与铁转运相关的多个未知功能基因,推测特殊的细胞铁代谢机制隐藏其中。本研究从宏观角度揭示了供试菌株面对不同溶氧时细胞生理代谢特点,并提供了该菌株既可以在高氧条件下生存,又可以在微氧和厌氧条件下高效吸收铁而合成磁小体的依据。鉴于转录组分析信息提示了 MGMSRv22046蛋白基因在磁小体合成的条件下明显上调,为探讨其与细胞生长、磁小体合成的关系,成功构建MGMSRv22046突变株Δ2046,通过细胞生理、生化多种检测发现,MGMSRv22046基因的突变不影响细胞生长,但细胞吸收铁的能力降低,磁小体合成滞后于野生型,细胞磁响应减弱;电子显微镜观察及磁学检测发现,突变株只能合成粒径小、个数少的不成熟磁颗粒。qPCR方法比较野生型与突变株磁小体合成前期和稳定期主要代谢途径关键基因转录水平,发现MGMSRv22046可能通过间接方式参与磁小体岛mms基因转录,调控细胞氧化还原状态平衡并根据一定溶氧条件适时启动异化型反硝化途径产能,促进磁小体的合成与晶体成熟。进一步比较野生型与突变株在不同氮源及供氧条件下异化型反硝化途径基因转录规律,结果表明,MSR-1菌株异化型反硝化途径基因转录仅受低氧诱导。分析蛋白序列与结构域,确定新发现的MGMSRv22046蛋白和已发表的MGMSRv22946(MgFnr)为Crp/Fnr家族的非典型Crp/Fnr蛋白,两者C端均含有Fnr C端与DNA结合的保守氨基酸ETXSR。采用足迹法(Foot printing)鉴定了 MGMSRv22046可识别nap上游包含Fnr-box 的18bp序列(GCATTTGATTTTGGTCAA),凝胶阻滞(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果证明,MGMSRv22046可结合自身以及nap、nir、nor、nos上游序列,摆脱传统低氧感应调控因子Fnr对溶氧浓度的限制,从而提高趋磁螺菌异化型反硝化途径基因启动时氧浓度的阈值。提出了在微氧条件下,MSR-1细胞中的MGMSRv22046与MGMSRv22946蛋白正调控异化型反硝化途径启动产能的工作模型,由此修订并补充了微生物细胞硝酸盐呼吸产能的条件。本研究结果不仅为探讨低营养、低溶氧条件下磁小体合成提供理论依据和实验证据,也为扩展异化型反硝化途径的调控提供了新的信息,揭示了趋磁螺菌MSR-1菌株在高氧、微氧、或厌氧环境的应对策略,对趋磁细菌强大的适应性给予理论和实验证据的补充,同时为进一步探讨趋磁螺菌的生物矿化机制奠定基础。
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