[背景与目的]生物钟系统在维持机体外周器官正常的生理功能昼夜节律表达具有重要的意义。本团队前期研究证实肾脏疾病时肾脏生物钟系统被破坏,影响肾脏正常的生理功能,参与血压和尿钠昼夜节律紊乱的分子发病机制。在临床上,肾病患者不仅仅表现为血尿、蛋白尿或肾功能的异常,还出现广泛的肾外脏器功能紊乱,如血脂异常、贫血、骨病及心脑血管并发症,部分还表现为心肾综合征、肝肾综合征等。本研究拟观察在肾病状态下肾外其他外周脏器局部生物钟系统的节律表达情况,进而探讨生物钟系统在肾脏与其他脏器之间的Crosstalk对话的媒介作用。[研究方法]一、动物实验部分:将雄性SD大鼠(8周龄)随机分为两组,肾病组尾静脉注射阿霉素(6.5 mmg/kg),对照组给予等量的生理盐水。监测大鼠动态血压,每4 h每组处死3只大鼠留取血标本和心脏、肝脏组织,测定肝功能、血脂、血糖及血浆肾素活性、醛固酮浓度及血管紧张素浓度变化。应用实时定量PCR方法检测心脏和肝脏核心生物钟基因及下游各脏器特有功能相关钟控基因的mRNA表达。应用傅里叶分析合并逐步回归的分析方法进行节律分析。二、临床上纳入我院肾内科住院肾穿病理提示膜性肾病的中青年患者及健康对照者,监测24h动态血压,同步留取每4h段尿,采用超速离心法提取尿外泌体,应用实时定量PCR的方法检测尿外泌体中核心生物钟基因及肾脏钟控基因EVaC、NCC和NHE3的mRNA表达结果,进行节律分析。三、从GEO数据库中下载数据肾病患者和健康对照外周血单个核细胞和肾组织的基因芯片表达谱数据,利用R软件包对基因表达差异表达分析,并选取生物钟基因及钟控基因进行生物信息学分析。[研究结果]一、动物实验部分:1、肾病大鼠血压昼夜节律紊乱伴随心脏生物钟系统破坏(1)对照组正常大鼠的血压具有昼夜节律(P<0.05),但肾病大鼠收缩压的节律周期完全消失。(2)对照组大鼠心脏生物钟基因CLOCK、BMAL1、Cry1、Cry2、Per1、Per2的mRNA表达具有昼夜节律的特点(均P<0.05)。而肾病大鼠心脏Cry1基因的节律周期从原有的12h变成(4.8+6)h(P<0.05),其余的核心钟基因节律消失(均P<0.05)。(3)对照组大鼠血浆肾素活性、醛固酮浓度分别呈12h和24h节律(均P<0.05);而肾病大鼠血浆肾素、醛固酮表达下降,节律完全消失(均P>0.05)。2、肾病大鼠肝脏生物钟及钟控基因节律表达与血脂异常相关(1)对照组大鼠的TC、TG、AST、ALT浓度分别具有周期震荡节律性,分别呈12h、24h,24h和24h的周期节律(均P<0.05);而肾病组大鼠的上述节律性紊乱,TG的浓度节律从原有的24h变成12h,而TC、AST、ALT的浓度节律表达完全消失(均P>0.05);(2)对照组大鼠的肝脏核心钟基因均出现“昼高夜低”的节律表达,除了基因Per1节律为4.8h,其余的钟基因节律均为24h;肾病大鼠核心钟基因Cry1和Per2仅出现峰值的改变,仍然维持24h的昼夜节律,而其余的钟基因出现明显的节律改变;(3)肾病大鼠Per1钟基因下游肝脏特有血脂代谢、胆固醇转运相关钟控基因LXR、Srebp-1、C1和CYP7表达昼夜节律发生紊乱(均P<0.05)。二、临床研究部分:1、肾病患者尿外泌体肾脏特异性钟控基因的节律表达研究(1)健康对照组的尿外泌体中核心生物钟基因的表达具有昼夜节律的特点(均P<0.05)。肾病患者尿外泌体中BMAL1基因的表达仍有周期震荡的特点,但节律周期从原有的8h变成了(4.8+6)h;其余的核心钟基因CLOCK、Cry1、Cry2、Per1、Per2 mRNA表达节律完全消失(均P<0.05)。(2)健康对照组尿外泌体中肾脏特有水钠转运相关钟控基因ENaC、NCC和NHE3的mRNA表达具有昼夜节律的特点(均P<0.05);节律周期分别为(4.8+12)h、(4.8+8)h和24h;而肾病患者的尿外泌体中的ENaC、NCC和NHE3昼夜节律完全消失(均P<0.05)。2、肾病患者外周血单个核细胞(PBMC)和肾组织钟基因的表达差异分析(1)对基因芯片数据库分析,膜性肾病患者外周血PBMC的核心生物钟基因CLOCK、BMAL1、Cry1、Per1、Dec1和Dec2的表达均较健康对照者降低(均P<0.05),Cry2和Per2也呈现减少趋势,但无统计学意义(P>0.05)。(2)数据库中肾病患者肾组织活检标本和癌旁肾组织标本中核心生物钟基因表达分析,MCD、MN、FSGS患者肾组织除了Dec1钟基因的表达与对照组无统计学差异(P>0.05),其余核心钟基因CLOCK、BMAL1、Cry1、Cry2、Per1、Per2和Dec2表达均升高(均P<0.05);钟控基因NCC、ENCC表达降低,而NHE3、肾素及血管加压素受体基因表达升高(均P<0.05);但各个肾病组之间比较并无统计学差异。(3)生物信息学分析:将心、肝、肾组织钟基因进行聚类分析,构建PPI可视化网络,发现这些基因聚为4大类基因集团,核心生物钟系统为相互间关系最密切的基因集,各脏器自身功能基因交互关系密切,不同脏器功能基因集团之间具有联系。[结论]1、肾病状态下,大鼠固有的保守的肾脏、心脏以及肝脏外周组织生物钟系统被破坏,与肾病大鼠呈现的血压、尿钠、转氨酶和血脂的昼夜节律紊乱表现具有协同一致性。肾脏疾病导致肾脏生物钟系统受损,同时累及其他外周脏器生物钟系统和生理功能昼夜节律紊乱,生物钟系统可能为疾病状态下外周组织脏器Crosstalk的潜在媒介。2、健康志愿者尿外泌体中核心生物钟基因及肾脏特异的钟控基因都具有昼夜节律表达的特点,证实监测尿外泌体生物钟基因表达可为我们提供研究人类肾脏疾病时间生物学的简便、可行、可靠手段。肾病患者尿外泌体的核心生物钟基因及肾脏功能钟控基因ENaC、NCC和NHE3的昼夜节律消失,进一步说明了人类肾脏器质性损害可导致肾脏生物钟系统紊乱。3、数据库中肾病患者PBMC和肾组织中的生物钟系统钟基因表达与正常对照相比也出现了显著的统计学差异,也佐证了在肾病状态下,人外周血和肾组织的生物钟系统出现异常。4、生物信息学分析证实人类生物钟基因编码蛋白与心肝肾功能相关钟控基因编码蛋白存在相关性,生物钟系统可能是肾病状态下心肝肾外周组织脏器之间的Crosstalk的潜在媒介。