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目的：
随着我国工业化和城镇化加速发展，臭氧(ozone，O3)污染问题日益凸显。O3可通过氧化应激、炎症、气道高反应性等机制危害呼吸道，与呼吸系统疾病密切相关。经典瞬时受体6(canonical transient receptor potential 6，TRPC6)通道是对氧化还原敏感的非选择性阳离子通道，活性氧既可以调控TRPC6的表达，也可以调节TRPC6通道功能。TRPC6通道激活引起细胞内钙离子浓度(intracellularcalciumconcentration，[Ca2+]i)升高，调控下游信号通路参与氧化应激引起的器官损伤。前期实验发现O3暴露后小鼠肺组织TRPC6表达显著升高，与中性粒细胞浸润呈正相关。文献报道，O3暴露还会引起气道上皮细胞的细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表达的上调。ICAM-1及其配体参与调控气道上皮细胞与白细胞的粘附，在气道炎症反应中起重要作用。本课题拟探究TRPC6在O3致小鼠气道中性粒细胞浸润中的作用及其与ICAM-1的关系，将有助于阐明O3致气道炎症反应的分子机制，为O3致气道炎症的防治提供新的思路。
方法：
以TRPC6敲除(TRPC6-/-)小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠作为研究对象，进行O3暴露动物实验。以人支气管上皮细胞株16HBECs和人原代支气管上皮细胞作为研究对象，进行O3暴露细胞实验。
(1)对16HBECs和人原代支气管上皮细胞进行6h100ppb的O3暴露，钙成像检测O3暴露对Hyp9刺激引起[Ca2+]i升高的影响。
(2)DNA琼脂糖电泳鉴定小鼠基因型。
(3)RealtimePCR检测TRPC6-/-小鼠和WT小鼠肺部TRPCmRNA水平。
(4)8-10周龄时，进行TRPC6-/-小鼠和周龄匹配的WT小鼠暴露实验。第1、3、5天，WTO3组和TRPC6-/-O3组在1ppmO3环境中暴露3h，同时WTControl组和TRPC6-/-Control组暴露在洁净空气中。末次暴露24h后收集支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)，肺组织取材和固定，制备肺切片。
(5)BALF白细胞计数与分类计数。
(6)蛋白印迹法(western blot)检测肺组织ICAM-1和NF-κB蛋白表达水平。
(7)免疫组化观察肺切片ICAM-1蛋白的表达和定位。
(8)对16HBECs进行持续时间为6h，浓度为100ppb的O3暴露，在停止O3暴露6h、12h和24h后提取细胞蛋白，westernblot检测ICAM-1蛋白表达水平。
(9)对16HBECs进行持续0.25h、0.5h、1h和2h，浓度为100ppb的O3暴露，停止暴露后立即提取细胞蛋白，westernblot检测NF-κB蛋白磷酸化水平。
(10)使用TRPC6shRNA重组慢病毒沉默16HBECsTRPC6的表达，westernblot检测TRPC6沉默效率。
(11)Hyp9作为TRPC6高选择性激活剂激活TRPC6通道，钙成像检测TRPC6沉默效率。
(12)对16HBECs进行6h100ppbO3暴露，westernblot检测TRPC6沉默对停止O3暴露24h后16HBECsICAM-1蛋白表达水平的影响。
(13)对16HBECs进行0.5h100ppb浓度的O3暴露，westernblot检测TRPC6沉默对O3暴露后NF-κB蛋白磷酸化水平的影响。
(14)使用TRPC6特异性抑制剂醋酸落叶松酯(larixyl acetate，LA)抑制TRPC6通道活性，钙成像验证LA对人原代支气管上皮细胞TRPC6通道的抑制作用。
(15)对16HBECs进行6h100ppbO3暴露，westernblot检测LA对O3停止暴露24h后16HBECsICAM-1蛋白表达水平的影响。
(16)使用无钙培养基为16HBECs和人原代支气管上皮细胞换液，构建细胞外无Ca2+的环境，钙成像检测无Ca2+环境对Hyp9刺激引起的[Ca2+]i升高的影响。
(17)对16HBECs进行6h100ppbO3暴露，westernblot检测细胞外Ca2+对O3停止暴露24h后16HBECsICAM-1蛋白表达水平的影响。
(18)分离人外周血中性粒细胞，吉姆萨-瑞氏复合染色和流式细胞术检测细胞纯度。
(19)对16HBECs进行6h100ppb的O3暴露，停止O3暴露12h后接种中性粒细胞共培养，24h后吉姆萨-瑞氏复合染色观察16HBECs粘附中性粒细胞功能。
(20)利用慢病毒、LA和无钙培养基，观察TRPC6和胞外Ca2+在O3暴露引起16HBECs黏附中性粒细胞功能改变中的作用。
结果：
(1)WT小鼠肺组织TRPC1mRNA表达水平最高，TRPC6次之。除TRPC6外，TRPC6-/-小鼠其他TRPCsmRNA表达水平与WT小鼠无明显差异(P＞0.05)。
(2)O3暴露后WT小鼠和TRPC6-/-小鼠BALF中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞数均明显增加(P＜0.01)。与WTO3组相比较，TRPC6-/-O3组BALF中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞数明显减少(P＜0.01)。
(3)O3暴露后WT小鼠肺组织NF-κB和ICAM-1蛋白表达均明显增加(P＜0.01)，TRPC6-/-小鼠则无明显改变(P＞0.05)。
(4)WTControl组、TRPC6-/-Control组和TRPC6-/-O3组小鼠ICAM-1蛋白低表达于肺血管内皮细胞和支气管上皮细胞。WTO3组小鼠ICAM-1蛋白高表达于肺血管内皮、支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞。
(5)与Control组相比，O3组钙峰值明显增高(P<0.01)。
(6)与Control组相比较，O3+6h组和O3+12h组16HBECsICAM-1蛋白表达水平均无明显差异(P＞0.05)，O3+24h组ICAM-1蛋白表达水平明显增高(P＜0.01)。
(7)与Control组相比较，0.25hO3组、1hO3组和2hO3组NF-κB蛋白磷酸化水平均无明显差异(P＞0.05)。0.5h组NF-κB蛋白磷酸化水平明显增高(P＜0.01)。
(8)TRPC6shRNA重组慢病毒有效沉默16HBECsTRPC6蛋白表达，沉默效率达77.4%。
(9)Hpy9作用于16HBECs引起[Ca2+]i快速升高，形成钙峰并维持120s。与NCshRNA组相比较，TRPC6shRNA组钙峰峰值明显降低(P＜0.01).
(10)与NCshRNAO3组相比较，TRPC6shRNAO3组16HBECsICAM-1蛋白表达水平明显减低(P＜0.01)。
(11)与NCshRNAO3组相比较，TRPC6shRNAO3组16HBECsNF-κB蛋白磷酸化水平明显减低(P＜0.01)。
(12)Hpy9作用于人原代支气管上皮细胞引起[Ca2+]i快速升高，形成钙峰并维持350s。与Control组相比较，10μMLA组钙峰峰值明显降低(P＜0.01)。
(13)与O3组相比较，5μMLA+O3组和10μMLA+O3组16HBECsICAM-1蛋白表达水平明显减低(P＜0.01)，1μMLA+O3组则无明显差异(P＞0.05)。
(14)与Control组相比较，0Ca2+组钙峰值明显降低(P＜0.01)。
(15)与O3组相比较，0Ca2++O3组16HBECsICAM-1蛋白表达水平明显减低(P＜0.01)。
(16)分离的中性粒细胞纯度达90%以上。
(17)与Control组相比较，O3组16HBECs对中性粒细胞的粘附明显增加(P＜0.01)。与O3组相比较，与TRPC6shRNA组、10μMLA+O3组和0Ca2++O3组16HBECs对中性粒细胞的粘附明显减少(P＜0.01)，NCshRNA组16HBECs对中性粒细胞的粘附能力无明显差异(P＞0.05)。
结论：
(1)TRPC6敲除可以明显抑制O3暴露引起的小鼠BALF中白细胞数的增加，尤其是中性粒细胞数的增加，减轻气道炎症。
(2)TRPC6敲除可以明显抑制O3暴露引起的小鼠肺组织ICMA-1和NF-κB蛋白表达水平的上调。
(3)O3暴露后16HBECs对中性粒细胞的粘附明显增加，其机制可能是上调16HBECsTRPC6通道活性，通过TRPC6/Ca2+/NF-κB通路介导ICMA-1蛋白表达增加。
随着我国工业化和城镇化加速发展，臭氧(ozone，O3)污染问题日益凸显。O3可通过氧化应激、炎症、气道高反应性等机制危害呼吸道，与呼吸系统疾病密切相关。经典瞬时受体6(canonical transient receptor potential 6，TRPC6)通道是对氧化还原敏感的非选择性阳离子通道，活性氧既可以调控TRPC6的表达，也可以调节TRPC6通道功能。TRPC6通道激活引起细胞内钙离子浓度(intracellularcalciumconcentration，[Ca2+]i)升高，调控下游信号通路参与氧化应激引起的器官损伤。前期实验发现O3暴露后小鼠肺组织TRPC6表达显著升高，与中性粒细胞浸润呈正相关。文献报道，O3暴露还会引起气道上皮细胞的细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表达的上调。ICAM-1及其配体参与调控气道上皮细胞与白细胞的粘附，在气道炎症反应中起重要作用。本课题拟探究TRPC6在O3致小鼠气道中性粒细胞浸润中的作用及其与ICAM-1的关系，将有助于阐明O3致气道炎症反应的分子机制，为O3致气道炎症的防治提供新的思路。
方法：
以TRPC6敲除(TRPC6-/-)小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠作为研究对象，进行O3暴露动物实验。以人支气管上皮细胞株16HBECs和人原代支气管上皮细胞作为研究对象，进行O3暴露细胞实验。
(1)对16HBECs和人原代支气管上皮细胞进行6h100ppb的O3暴露，钙成像检测O3暴露对Hyp9刺激引起[Ca2+]i升高的影响。
(2)DNA琼脂糖电泳鉴定小鼠基因型。
(3)RealtimePCR检测TRPC6-/-小鼠和WT小鼠肺部TRPCmRNA水平。
(4)8-10周龄时，进行TRPC6-/-小鼠和周龄匹配的WT小鼠暴露实验。第1、3、5天，WTO3组和TRPC6-/-O3组在1ppmO3环境中暴露3h，同时WTControl组和TRPC6-/-Control组暴露在洁净空气中。末次暴露24h后收集支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)，肺组织取材和固定，制备肺切片。
(5)BALF白细胞计数与分类计数。
(6)蛋白印迹法(western blot)检测肺组织ICAM-1和NF-κB蛋白表达水平。
(7)免疫组化观察肺切片ICAM-1蛋白的表达和定位。
(8)对16HBECs进行持续时间为6h，浓度为100ppb的O3暴露，在停止O3暴露6h、12h和24h后提取细胞蛋白，westernblot检测ICAM-1蛋白表达水平。
(9)对16HBECs进行持续0.25h、0.5h、1h和2h，浓度为100ppb的O3暴露，停止暴露后立即提取细胞蛋白，westernblot检测NF-κB蛋白磷酸化水平。
(10)使用TRPC6shRNA重组慢病毒沉默16HBECsTRPC6的表达，westernblot检测TRPC6沉默效率。
(11)Hyp9作为TRPC6高选择性激活剂激活TRPC6通道，钙成像检测TRPC6沉默效率。
(12)对16HBECs进行6h100ppbO3暴露，westernblot检测TRPC6沉默对停止O3暴露24h后16HBECsICAM-1蛋白表达水平的影响。
(13)对16HBECs进行0.5h100ppb浓度的O3暴露，westernblot检测TRPC6沉默对O3暴露后NF-κB蛋白磷酸化水平的影响。
(14)使用TRPC6特异性抑制剂醋酸落叶松酯(larixyl acetate，LA)抑制TRPC6通道活性，钙成像验证LA对人原代支气管上皮细胞TRPC6通道的抑制作用。
(15)对16HBECs进行6h100ppbO3暴露，westernblot检测LA对O3停止暴露24h后16HBECsICAM-1蛋白表达水平的影响。
(16)使用无钙培养基为16HBECs和人原代支气管上皮细胞换液，构建细胞外无Ca2+的环境，钙成像检测无Ca2+环境对Hyp9刺激引起的[Ca2+]i升高的影响。
(17)对16HBECs进行6h100ppbO3暴露，westernblot检测细胞外Ca2+对O3停止暴露24h后16HBECsICAM-1蛋白表达水平的影响。
(18)分离人外周血中性粒细胞，吉姆萨-瑞氏复合染色和流式细胞术检测细胞纯度。
(19)对16HBECs进行6h100ppb的O3暴露，停止O3暴露12h后接种中性粒细胞共培养，24h后吉姆萨-瑞氏复合染色观察16HBECs粘附中性粒细胞功能。
(20)利用慢病毒、LA和无钙培养基，观察TRPC6和胞外Ca2+在O3暴露引起16HBECs黏附中性粒细胞功能改变中的作用。
结果：
(1)WT小鼠肺组织TRPC1mRNA表达水平最高，TRPC6次之。除TRPC6外，TRPC6-/-小鼠其他TRPCsmRNA表达水平与WT小鼠无明显差异(P＞0.05)。
(2)O3暴露后WT小鼠和TRPC6-/-小鼠BALF中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞数均明显增加(P＜0.01)。与WTO3组相比较，TRPC6-/-O3组BALF中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞数明显减少(P＜0.01)。
(3)O3暴露后WT小鼠肺组织NF-κB和ICAM-1蛋白表达均明显增加(P＜0.01)，TRPC6-/-小鼠则无明显改变(P＞0.05)。
(4)WTControl组、TRPC6-/-Control组和TRPC6-/-O3组小鼠ICAM-1蛋白低表达于肺血管内皮细胞和支气管上皮细胞。WTO3组小鼠ICAM-1蛋白高表达于肺血管内皮、支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞。
(5)与Control组相比，O3组钙峰值明显增高(P<0.01)。
(6)与Control组相比较，O3+6h组和O3+12h组16HBECsICAM-1蛋白表达水平均无明显差异(P＞0.05)，O3+24h组ICAM-1蛋白表达水平明显增高(P＜0.01)。
(7)与Control组相比较，0.25hO3组、1hO3组和2hO3组NF-κB蛋白磷酸化水平均无明显差异(P＞0.05)。0.5h组NF-κB蛋白磷酸化水平明显增高(P＜0.01)。
(8)TRPC6shRNA重组慢病毒有效沉默16HBECsTRPC6蛋白表达，沉默效率达77.4%。
(9)Hpy9作用于16HBECs引起[Ca2+]i快速升高，形成钙峰并维持120s。与NCshRNA组相比较，TRPC6shRNA组钙峰峰值明显降低(P＜0.01).
(10)与NCshRNAO3组相比较，TRPC6shRNAO3组16HBECsICAM-1蛋白表达水平明显减低(P＜0.01)。
(11)与NCshRNAO3组相比较，TRPC6shRNAO3组16HBECsNF-κB蛋白磷酸化水平明显减低(P＜0.01)。
(12)Hpy9作用于人原代支气管上皮细胞引起[Ca2+]i快速升高，形成钙峰并维持350s。与Control组相比较，10μMLA组钙峰峰值明显降低(P＜0.01)。
(13)与O3组相比较，5μMLA+O3组和10μMLA+O3组16HBECsICAM-1蛋白表达水平明显减低(P＜0.01)，1μMLA+O3组则无明显差异(P＞0.05)。
(14)与Control组相比较，0Ca2+组钙峰值明显降低(P＜0.01)。
(15)与O3组相比较，0Ca2++O3组16HBECsICAM-1蛋白表达水平明显减低(P＜0.01)。
(16)分离的中性粒细胞纯度达90%以上。
(17)与Control组相比较，O3组16HBECs对中性粒细胞的粘附明显增加(P＜0.01)。与O3组相比较，与TRPC6shRNA组、10μMLA+O3组和0Ca2++O3组16HBECs对中性粒细胞的粘附明显减少(P＜0.01)，NCshRNA组16HBECs对中性粒细胞的粘附能力无明显差异(P＞0.05)。
结论：
(1)TRPC6敲除可以明显抑制O3暴露引起的小鼠BALF中白细胞数的增加，尤其是中性粒细胞数的增加，减轻气道炎症。
(2)TRPC6敲除可以明显抑制O3暴露引起的小鼠肺组织ICMA-1和NF-κB蛋白表达水平的上调。
(3)O3暴露后16HBECs对中性粒细胞的粘附明显增加，其机制可能是上调16HBECsTRPC6通道活性，通过TRPC6/Ca2+/NF-κB通路介导ICMA-1蛋白表达增加。