超低温保存是指将生物材料采用一定技术存入液氮中保存,使用时采取一定方法使其恢复生长,已成为种质资源保存的先进技术。目前,人们认为超低温保存是种质资源实现“永久”保存的唯一方法,但由于技术是近几十年逐渐成熟起来的,缺乏对液氮较长期保存的连续监测。本文对超低温保存6～11年的107个种/品种园林植物花粉的生活力进行测定,结合本课题组对花粉生活力的多年跟踪研究结果,评价花粉经过长期保存后的保存效果。选择花粉库长期保存后生活力不同变化类型的植物花粉进行相关生理研究,以揭示花粉超低温保存效果差异的生理机制,为花粉长期乃至“永久”保存的可行性奠定基础。主要研究结论如下:1)对超低温花粉库保存6～11年的花粉的效果进行评价,表明77.6%的园林植物(83个种/品种)在多年超低温保存后仍具有一定萌发率,说明超低温保存技术是花粉进行长期保存的有效方式。2)长期超低温保存后,花粉生活力与当时新鲜花粉(CK)相比,出现三类不同变化趋势,包括生活力升高、生活力平稳、生活力降低,分别占花粉库(107个种/品种)花粉的 11.2%、20.6%和 68.2%。3)超低温保存6～11年后,与当时新鲜花粉(CK)相比,生活力升高的花粉02·-含量、H202含量和产生OH·的能力降低或无显著变化,MDA含量检测结果表明没有发生显著的氧化损伤;生活力平稳的花粉O2·-含量、H202含量和产生OH·的能力呈波动变化,但也未发生显著的氧化损伤或损伤较小;生活力降低的花粉活性氧含量波动上升显著,且大多数种类发生了氧化损伤。相关性分析表明,膜脂质过氧化程度与花粉生活力变化成负相关,花粉内MDA含量与产生OH·能力呈正相关,蛋白质羰基化程度与H202和产生OH·的能力呈正相关,表明ROS是花粉长期保存后生活力变化的主要因子之一。4)超低温保存6～11年后,保存效果不同的花粉抗氧化系统相关物质的变化也存在差异:生活力升高类和平稳类花粉CAT活性和AsA含量升高或基本保持稳定,而生活力降低类花粉CAT活性和AsA含量大多有所降低。除’紫凤朝阳’外,GR活性均升高,且生活力升高类花粉GR活性升高比例较大。相关性分析表明,H202含量、产生OH·的能力与CAT活性、GR活性、POD活性、APX活性、AsA含量呈显著相关性,抗氧化物质对活性氧的清除起到了重要作用,并且抗坏血酸-谷胱甘肽循环对活性氧的清除也起到了一定的作用。5)超低温保存6～11年后,生活力升高类花粉凋亡酶活性均低于新鲜花粉,生活力平稳类和降低类花粉凋亡酶活性大多经过波动变化和保存前无显著差异或有所降低。超低温保存后凋亡率均呈现一定升高,但并未对花粉生活力造成影响,且各种花粉均未出现DNA片段化现象。本研究结果表明,本课题组建立的园林植物花粉超低温保存库保存的花粉经6～11年仍有31.8%植物的花粉与当时入库时新鲜花粉对照无显著差异或显著高于对照,表明超低温保存花粉有实现“永久”的潜力,证实了花粉库的可靠性。经过6～11年保存后生活力呈现升高、平稳和降低三种状态,花粉生活力升高和平稳的种类与其花粉粒内较低ROS含量和较活跃的抗氧化物有关;同时表征细胞凋亡的凋亡酶活性较低,而花粉生活力降低类花粉凋亡酶活性较高,表明细胞凋亡在花粉超低温保存后生活力降低中有贡献,但三类花粉均未出现细胞凋亡晚期出现的DNA片段化现象,表明保存6～11年后,虽然有细胞凋亡发生,但尚未达到晚期。