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目的:利用生物信息学和体外细胞实验验证相结合的方法评估绞股蓝总皂苷(gypenosides,Gyps)对Graves’眼病(Graves’ophthalmopathy,GO)中眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts,OFs)炎症和纤维化的治疗效果。方法:1.基于生物信息学对Gyps治疗Graves’眼病潜在机制的探究通过检索Pub Med和Web of Science数据库,筛选描述Gyps治疗炎症和纤维化疾病作用靶点的文章进行数据提取。归纳总结Gyps相关的炎症和纤维化作用靶点,进行基因本体分析和通路分析等,构建蛋白质和基因相互作用网络。这一过程可在生物信息学角度对Gyps治疗Graves’眼病的潜在分子机制进行描绘。2.OFs的提取、培养与鉴定本课题所使用的OFs来自广西医科大学第一附属医院眼科行眼眶手术切除的眼眶结缔组织。采用酶消化法提取原代细胞进行培养,并利用形态学观察和免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)检测波形蛋白(VIM,vimentin)、S100钙结合蛋白B(S100B,S100 calcium binding protein B)、肌红蛋白(MB,myoglobin)、结蛋白(DES,desmin)和角蛋白17(KRT17,keratin 17)的方法对细胞种类进行鉴定。3.通过体外细胞实验对Gyps保护Graves’眼病中OFs的作用进行评估利用细胞增殖试剂盒检测不同浓度Gyps对OFs增殖的影响,筛选出细胞活性最强的Gyps浓度用于后续实验用特定浓度的Gyps对OFs进行预处理24小时后,分别使用IL-1β和TGF-β1刺激OFs达24小时来构建细胞炎症模型和纤维化模型。利用RT-q PCR(实时荧光定量聚合酶链式反应,real-time quantitative PCR)检测IL-6、IL-8、TNF-α和CCL2,以及HAS2、COL1A2、α-SMA和FN1的RNA表达水平;利用ELISA检测IL-6、TNF-α和CCL2,以及HA、Col I、α-SMA和FN的蛋白质表达水平;利用WB检测TLR4和NF-κB,以及SMAD2、p-SMAD2和SMAD4的蛋白质表达水平。结果:1.生物信息学证实Gyps可通过抗炎和抗纤维化作用治疗GO通过文献数据提取得到Gyps治疗炎症(TNF、IL1B、IL5、MAPK14、NFKB1、STAT1、PPARG和VCAM1)和纤维化(MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、TGFB1、SMAD7、CCN2、ALDH1B1和PPARA)的作用靶点,对上述靶点进行基因本体分析和通路分析可发现Gyps可通过若干相关通路影响炎症和纤维化过程。2.成功分离和培养高纯度OFs并进行鉴定利用酶消化法从眼眶结缔组织中提取出OFs,细胞形态呈长梭形或纺锤形,细胞贴壁生长且具有极性,在融合后可呈漩涡状。IHC结果显示OFs表达VIM,但不表达S100B、MB、DES和KRT17。3.体外细胞实验证实Gyps对GO患者OFs的保护作用通过IL-1β和TGF-β1刺激可成功构建OFs的炎症和纤维化模型,而Gyps可降低炎症、纤维化相关m RNA和蛋白质的表达水平。结论:1.生物信息学分析证实Gyps可通过抗炎和抗纤维化作用保护GO中的OFs,其结果可为后续体外细胞实验验证提供理论基础。2.可通过酶消化法提取高纯度的OFs,并可利用IHC检测VIM表达阳性、S100B、MB、DES和KRT17表达阴性的方式进行鉴定。3.Gyps或许可通过作用于NF-κB信号通路介导的抗炎作用和TGF/SMADs的抗纤维化作用对GO起到治疗作用。