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目的:构建 RNAi- CD59慢病毒载体,研究其对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat CD59的沉默效应,运用体内和体外实验探讨CD59特异性沉默对肿瘤细胞免疫逃逸的作用。 方法体外实验:免疫荧光比较正常人T细胞和Jurkat细胞上的CD59表达情况;构建 CD59干扰序列(RNAi-CD59-A、RNAi-CD59-B、RNAi-CD59-C)以及错义序列(RNAi-NC)融合绿色荧光蛋白,以慢病毒为载体转染进入人急性T系白血病Jurkat细胞株,阴性对照为RNAi-NC,空白对照组为未经任何处理的正常培养的Jurkat细胞系;运用荧光显微镜和流式细胞仪检测各组细胞的转染效率; RT-PCR检测各组CD59基因以及凋亡相关基因Bcl-2/Bax mRNA的表达;Western-blot检测各组CD59蛋白以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、 Caspase-3、Survivin蛋白表达水平的变化;激光共聚焦观察CD59分子的定位;ELISA检测各组细胞培养上清中IL-3、TNF-P的表达;CCK8检测各组细胞增殖效率的改变;流式细胞仪观察各组细胞凋亡水平的变化。 体内实验:24只BALB/c-nu雌性裸鼠随机分为4组(PBS组、Jurkat组、RNAi-NC组、RNAi-CD59-A组),将培养筛选后的细胞系通过尾静脉注射进入裸鼠体内构建裸鼠转移瘤模型,注射前后0周、1周、2周、3周、4周,监测小鼠生长状态、小鼠体质量及外周血白细胞数量的变化;流式细胞检测技术观察小鼠外周血及骨髓中淋巴细胞的凋亡情况;ELIS A检测各组小鼠血液上清中IL-3、TNF-P的表达。 结果体外实验:荧光显微镜和FCM观察转染效率在90.00%以上; RT-PCR结果显示沉默组CD59、 Bcl-2 mRNA表达水平降低(P<0.05),Bax mRNA表达水平升高(P<0.05); Western-blot结果显示沉默组CD59、Bax、Survivin蛋白的表达量减少,Bcl-2, caspase-3蛋白的表达量增多(P<0.05);激光共聚焦观察到CD59分子主要定位于细胞膜;ELIS A结果显示沉默组IL-3表达水平降低,TNF-P的表达水平升高(P<0.05);CCK8结果显示RNAi-CD59-A组的细胞增殖效率明显降低(P<0.05);流式细胞仪观察到RNAi-CD59-A组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。 体内实验:动物模型构建成功,与 PBS组相比,各模型组裸鼠体质量均有一定的下降(P<0.05),其中沉默组裸鼠体质量下降不如RNAi-NC组和Jurkat细胞组明显(P<0.05);与 PBS组相比,各模型组外周血白细胞数均有明显的升高(P<0.05),其中与Jurkat细胞和RNAi-NC组相比,沉默组外周血白细胞计数减少(P<0.05);流式细胞仪结果显示沉默组外周血和骨髓细胞中的细胞凋亡率明显高于未沉默组(P<0.05);ELIS A结果显示小鼠血液上清中沉默组IL-3表达水平降低,TNF-P的表达水平升高(P<0.05)。 结论: RNAi-CD59转染细胞系及白血病转移瘤模型均构建成功,在体内外均验证了沉默CD59基因表达可抑制急性T系白血病的增殖并诱导细胞凋亡,为临床急性 T系白血病的诊断和治疗提供了一个全新的思路。