研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种与衰老密切相关的神经系统退行性病变,以进行性认知能力下降和社会功能障碍为临床特点。AD的发病机制尚未完全阐明,目前应用的临床药物仅为对症治疗,无法防止病情进展。β淀粉样蛋白(Amyloid beta, Aβ)是AD重要的致病物质。Ap产生和清除平衡障碍导致脑内Ap过度沉积,被认为是散发型AD(约占全部AD的99%)主要的发病原因。清除脑内Aβ是AD防治的一个重要策略。Ap清除包括从中枢途径清除(中枢清除)和从外周途径清除(外周清除)。目前开展的一系列以抗Ap抗体免疫治疗为代表的清除Ap的临床研究均未成功。其主要原因被认为是干预时间太晚。同时,在临床试验中出现的脑炎、血管损害等副作用也是影响免疫治疗安全性的重要因素。免疫治疗的这些副作用均与抗体进入脑内(中枢清除)有关。因此,避免药物进入脑内,通过外周途径清除脑内Aβ可能是一条更为安全的途径。然而,Aβ的外周清除目前仍存在诸多困惑。其一,虽然多项研究提示外周脏器、组织和分子具有清除Ap的作用,但生理条件下整个外周系统清除脑内Ap的能力和有效性尚不清楚。其二,之前研究者通过在外周途径给予药物以验证Aβ外周清除是否能降低脑内Ap水平的研究结论也存在争议。因此,明确机体Ap外周清除的能力和机制,阐明Aβ外周清除能力在AD发生中的作用,对于深入理解AD发生机制,建立安全有效的AD防治措施,具有重要的科学意义和临床应用前景。材料与方法1.机体外周脏器组织的Aβ清除能力的检测纳入30例房室折返性心动过速患者,在射频消融术中,采集上腔静脉、下腔静脉(肝静脉开口近端)、股动脉和股静脉血液,分离血清。同时,采用APP/PS1转基因AD小鼠10只,通过手术方法采集颈静脉、腹主动脉和后腔静脉血液,分离血清。采用ELISA方法,检测成人和APP/PS1转基因AD小鼠循环系统不同部位血液Aβ水平,比较静脉血与动脉血Aβ水平的比值。2.外周脏器组织Aβ代谢能力的检测采用野生型C57BL/6J小鼠14只,进行放射性同位素实验,通过尾静脉注射125I标记的Aβ,2小时后采集各主要外周脏器和组织,利用伽马射线计数器测量各个主要外周脏器和组织的放射性计数,观察Aβ在外周主要脏器和组织的生物分布。3.并联共生动物模型的建立建立并联共生(Parabiosis)动物模型,通过手术方法将APP/PS1小鼠同野生型C57BL/6J小鼠进行并联,借此给APP/PS1小鼠增加一套完整的外周系统。预防实验中,采用3月龄雌性APP/PS1小鼠(此时小鼠脑内尚无大量Ap沉积及病理改变形成)与同龄同性别野生型小鼠并联,9月龄时进行组织取材及检测。治疗实验中,采用9月龄雌性APP/PS1小鼠(此时小鼠脑内已有大量Ap沉积及病理改变形成)与同龄同性别野生型小鼠并联,12月龄时进行组织取材及检测。4.AD脑内Aβ水平的检测采用刚果红染色、免疫组化染色、ELISA检测,观察并联共生对APP/PS1小鼠脑内老年斑、Ap沉积以及脑组织提取液内Ap水平的影响。采用刚果红染色、免疫荧光双重标记以及普鲁士蓝染色,观察并联共生对APP/PS1小鼠脑血管淀粉样变(Cerebral amyloid angiopathy, CAA)和脑微出血的影响。采用免疫蛋白印迹,观察并联共生对APP/PS1小鼠脑内淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)及其代谢产物、与Aβ合成和分解有关的酶以及转运受体的影响。5.AD脑内相关病理的检测采用免疫组化染色、免疫荧光多重标记、ELISA检测以及免疫蛋白印记,观察并联共生对APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞活化、细胞因子水平、Tau蛋白过度磷酸化的影响。采用免疫荧光双重标记和免疫蛋白印记,观察并联共生对APP/PS1小鼠脑内神经元缺失、凋亡和突触变性坏死的影响。结果1.机体存在天然的Aβ外周清除能力以动脉血(成人为股动脉血,APP/PS1小鼠为腹主动脉血)Aβ水平作为参照,计算每个个体不同部位静脉血Ap水平与动脉血Ap水平的比值。通过比较上述比值显示,成人上腔静脉血Aβ40和总Aβ (Aβ40+Aβ42)水平显著高于股静脉血,股静脉血Aβ40和总Aβ水平显著高于下腔静脉血。同时,APP/PS1小鼠颈静脉血Aβ40和总Ap水平显著高于后腔静脉血。另外,3月龄野生型小鼠尾静脉注射1251标记的Aβ后2小时,皮肤、胃肠道和肝脏放射性计数占总放射性计数的比值明显高于心脏、脾脏、肺脏和脑,肝脏、肾脏、胃肠道和皮肤单位重量脏器放射性计数显著高于其他脏器。2.并联共生显著预防Aβ在AD脑内沉积预防实验中,采用刚果红染色,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内刚果红染色阳性面积占总观察面积百分比(Area fraction%)较对照组APP/PS1小鼠明显减少,其中,新皮层减少约77.43%(0.3164±0.0259 vs 1.4016±0.0497, P<0.01),海马减少约71.22%(0.02636±0.0236 vs 0.9159±0.0631, P<0.01)。同时,9月龄并联APP/PS1小鼠单位面积脑片上刚果红染色阳性颗粒的数量(Plaque No./mm2)较对照组APP/PS1小鼠明显减少,其中,新皮层减少约80.10%(13.7758±1.5062 vs 69.2223±3.4455,P<0.01),海马减少约76.58%(10.8991±1.3055 vs 46.5435±3.1947,P<0.01)。采用6E10抗体免疫组化染色,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内6E10抗体免疫组化染色阳性面积占总观察面积百分比(Area fraction%)较对照组APP/PS1小鼠明显减少,其中,新皮层减少约85.97%(5.8096±0.9244 vs 41.4155±2.0209, P<0.01),海马减少约82.62%(3.3584±0.6359 vs19.3194±1.4791,P<0.01)。同时,9月龄并联APP/PS1小鼠单位面积脑片上6E10抗体免疫组化染色阳性颗粒的数量(Plaque No./mm2)较对照组APP/PS1小鼠明显减少,其中,新皮层减少约80.49%(20.3321±2.4963 vs 104.2200±4.4021,P<0.01),海马减少约83.56%(9.0656±1.0702 vs 55.1584±2.1844,P<0.01)。此外,脑组织提取液内Ap测定显示,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内Aβ40在TBS、2%SDS、70%甲酸三种提取液中的水平均明显低于对照组APP/PS1小鼠(TBS:0.1148±0.0100 vs 0.0436±0.0056, P<0.01; 2%SDS: 0.7417±0.0835 vs 0.1333±0.0236, P<0.01; 70%甲酸：3.0781±0.3233 vs 1.0512±0.1440,P<0.01)。同时,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内Aβ42在三种提取液中的水平亦明显低于对照组APP/PS1小鼠(TBS:0.5219±0.0519 vs 0.2251±0.0328,P<0.01; 2%SDS: 0.8295±0.1211 vs 0.3249±0.0521, P<0.01; 70%甲酸：3.5536±0.2662 vs 1.0570±0.1129,P<0.01)。进一步计算脑内总Aβ (Aβ40+Aβ42)可见,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内总Aβ无论是各个提取液内的水平(TBS:0.6367±0.0577 vs 0.2687±0.0338, P<0.01; 2%SDS: 1.5712±0.0901 vs 0.4582±0.0639, P<0.01; 70%甲酸：6.6317±0.3913 vs 2.1083±0.2173,P<0.01),还是各种提取液内水平之和(8.8396±0.4034 vs 2.8352±0.2520,P<0.01),均明显低于对照组APP/PS1小鼠。另外,较对照组APP/PS1小鼠而言,9月龄并联APP/PS1小鼠CAA面积占比和平均数量以及脑内微出血数量均明显减少。同时,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内APP及其代谢产物C末端片段(C terminal fragment, CTF)-α、CTF-β,Aβ生成限速酶BACE1及Aβ降解酶IDE、NEP、Aβ转运受体LRP-1和RAGE的表达无变化。3.并联共生显著抑制AD脑内Aβ沉积的增长治疗实验中,采用刚果红染色,12月龄并联APP/PS1小鼠新皮层刚果红染色阳性面积占总观察面积百分比(Area fraction%)较对照组APP/PS1小鼠明显减少约17.10%(1.4134±0.0888 vs 1.7049±0.0396,P<0.05),同时,新皮层单位面积脑片上刚果红染色阳性颗粒的数量(Plaque No./mm)较对照组APP/PS1小鼠明显减少约16.94%(76.0826±3.7654 vs 87.9899±4.6522, P<0.05).治疗实验中,12月龄并联APP/PS1小鼠新皮层6E10抗体免疫组化染色阳性面积占总观察面积百分比(Area fraction%)较对照组APP/PS1小鼠明显减少约36.02%(48.6341±2.2949 vs 76.0197±3.7302, P<0.01),海马减少约26.72%(23.2100±1.6363 vs 36.6794±2.4699,P<0.01)。同时,新皮层单位面积脑片上6E10抗体免疫组化阳性染色颗粒的数量(Plaque No./mm2)较对照组APP/PS1小鼠明显减少约28.60%(115.1200±4.1091 vs 161.2300±5.9683,P<0.01)。4.并联共生显著减轻AD相关病理特征较对照组APP/PS1小鼠而言,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞标志物CD45抗体、星形胶质细胞标志物GFAP抗体免疫组化染色阳性区域面积占观察区域总面积占比(Area fraction%)显著减少,单位面积脑片上免疫组化染色阳性的细胞数量(Cell No./mm2)显著减少。同时,9月龄并联APP/PS1小鼠脑匀浆内细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平较对照组APP/PS1小鼠显著降低。另外,9月龄并联APP/PS1小鼠脑内Tau蛋白磷酸化位点标志物pS396抗体免疫组化染色阳性区域面积占观察区域总面积占比(Area fraction%)显著减少,单位面积脑片上pS396抗体免疫组化染色阳性的细胞数量(Cell No./mm2)显著减少。同时,与对照组APP/PS1小鼠比较,9月龄并联APP/PS1小鼠脑匀浆内pS396、pS199蛋白免疫印迹条带相对密度明显减少。同时,9月龄并联APP/PS1小鼠海马CA1区和CA3区神经元标志物NeuN抗体及CA1区神经元标志物MAP-2抗体免疫荧光标记阳性区域面积占观察区域总面积占比(Area fraction%)显著增多,海马CA3区细胞凋亡标志物Caspase-3抗体免疫荧光阳性标记区域面积占观察区域总面积占比(Area fraction%)显著减少。9月龄并联APP/PS1小鼠脑匀浆内突触后膜标志物PSD-93和PSD-95以及突触前膜标志物Synapsin-1和Synaptophysin表达明显增高。结论1.生理条件下,外周脏器组织具有清除脑内Aβ的能力,肝脏、肾脏、肠道和皮肤是Aβ外周清除的重要部位。2.增强Aβ外周清除能力可以减少AD脑内老年斑、Aβ沉积及脑组织提取液内Aβ水平,减少CAA及其导致的脑微出血等Aβ相关病理。3.增强Aβ外周清除能力可以减轻AD脑内小胶质细胞和星形胶质细胞活化、降低细胞因子水平、减轻Tau蛋白过度磷酸化。同时,Aβ外周清除能力减轻AD脑内神经元缺失、凋亡,减少突触变性坏死。4.Aβ外周清除是AD防治的有效途径,值得进一步探索。5.由于AD小鼠脑内约40%的Ap流向外周而被清除,提示外周脏器组织Ap清除能力下降可能参与AD的发生和发展,值得探索。