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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,Mps又称猪气喘病)的主要病原。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点,其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降,而且它能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而引起其他致病茵的继发感染。当病原从黏膜途径侵入机体,主要刺激机体黏膜免疫产生SIgA抗体。SIgA抗体在黏膜免疫中起到重要的作用。1对猪肺炎支原体组织毒毒力进行鉴定,并制备了标准阴阳性支气管-肺泡灌洗液样本。本次研究以总蛋白作为标准品进行校正,降低了样本采集而产生的误差.2利用实验室保存的猪肺炎支原体P36、P46、P97R1阳性质粒,用大肠杆菌表达系统表达了多种免疫蛋白；为猪肺炎支原体抗体检测方法的建立奠定了基础。3建立了单个蛋白的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化。本次实验重点为对封闭液进行优化,降低封闭液与样本之间的非特异性反应,最终选择1%酪蛋白作为封闭液,然后将ELISA其它工作条件进行固定,用于检测包被不同蛋白后样本特异性SIgA抗体水平。优化并固定的程序如下：将待包被蛋白用包被液稀释至2μg/mL。包被96孔酶标板,100μL孔37℃1h,4℃包被过夜；1%酪蛋白,200μL/孔37℃封闭2h；支气管-肺泡灌洗液样本1：20稀释,鼻试子样本不稀释,100μL/孔37℃2h。羊抗猪IgA-HRP 1:10000稀释100μL/孔37℃1h；然后用TMB显色液在37℃作用12min,最后用2MH2SO4终止反应。此外,检测血清中特异性的IgA间接ELISA检测方法的工作条件为：将待包被蛋白用包被液稀释至4μg/mL。包被96孔酶标板,100μL/孔37℃lh4℃包被过夜；1%酪蛋白200μL/孔 37℃封闭1h；血清样本1：20稀释100μL/孔37℃1h。羊抗猪IgA-HRP稀释至1：10000,100gL/孔 37℃1h；然后用TMB显色液在37℃作用10min,最后用2M H2SO4终止反应。4建立了用于检测猪呼吸道IgA抗体的双抗夹心ELISA方法,并对此方法进行了优化,优化后的程序如下：将待鼠抗猪IgA单抗蛋白用包被液稀释至1μg/mL。包被96孔酶标板,100μL/孔 37℃1h,4℃包被过夜；1%酪蛋白200μL/孔37℃封闭2h；支气管-肺泡灌洗液样本1：100稀释100μL/孔37℃2h。羊抗猪IgA-HRP 1:15000稀释,100μL/孔37℃1h；然后用TMB显色液在37℃作用5min,最后用2M H2SO4终止反应。5本试验所建立的间接ELISA方法对Mhp组织强毒攻毒后的鼻试子样本中特异性SIgA进行检测发现：Mhp阴性猪在攻毒后,在第6d能够检测到特异性SIgA抗体并在16d达到高峰；Mhp阳性猪在攻毒后的24小时内特异性SIgA抗体水平都开始下降,到第2d达到最低,随后开始恢复。P97R1、P46、P36三种蛋白的特异性SIgA的分泌规律具有一致性。这表明,P97R1、P46、P36三种蛋白都可以作为包被抗原用于呼吸道中Mhp特异性SIgA的ELISA建立。Mhp阴性猪感染后,在攻毒后第7d能够检测到血清中的P97R1特异性的IgA抗体并一直升高至28d；然而,整个试验过程都未能检测到P46,P36特异性IgA抗体.