论文部分内容阅读
目的:本实验采用4-硝基喹啉-氧化物(4NQO)建立小鼠食管癌前病变模型，以抑膈方为观察对象，以全反式维甲酸(ATRA)为阳性对照，观察抑膈方对食管癌前病变相关指标的干预作用，探讨抑膈方的部分机制。 方法: 分组:①正常组（20只），常规饲养。②模型组（30只），予4NQO诱癌，14周末造模成功，遂撤去4NQO。③阳性对照组（20只），造模成功后撤去4NQO，予0.1ml(0.15mg) ATRA溶液灌胃。④预防组(30只)，4NQO诱癌同时予抑膈方灌胃，每周3次，每次灌胃0.1ml(含免煎颗粒0.084g)抑膈方溶液。造模成功后撤去4NQO，继续灌胃。⑤治疗组（30只），造模成功后撤去4NQO，予抑膈方灌胃，剂量同预防组。每周记录各组小鼠体重1次，根据体重调整灌胃剂量。 24周末模型组小鼠出现癌变，全部处死小鼠，取14、24周末小鼠行HE染色，取24周末小鼠食管组织行透射电镜、免疫组化、RT-PCR检测。 结果: 1观察活体小鼠的一般状况 于2周后，模型组个别小鼠饮食量下降，活动度减弱，10周末毛发无光泽，颈部脱毛，有时会见发抖样，弓背卷缩;预防及治疗组小鼠饮食量、活动度、毛发光泽度较阳性对照组好，且无脱毛现象;预防组小鼠较治疗组精神状态、活动度稍好。实验过程中预防组死亡3只，模型组及阳性对照组、治疗组各死亡2只。 2各组小鼠食管的大体观察 将食管纵形剖开，14周末，正常组小鼠食管粘膜未见异常;模型组小鼠食管粘膜充血、或灰暗，局部隆起，可见灰白斑点、斑块。预防组小鼠食管粘膜色红，未见灰白隆起及斑点、斑块的形成。实验末，正常组小鼠未见肉眼病变，模型组小鼠食管粘膜出现乳头状瘤，并可见溃疡面形成。阳性对照组、预防组、治疗组小鼠出现乳头状瘤，可见白色斑块。 3光镜下各组小鼠食管组织病理学观察 正常组小鼠14、24周末食管上皮未见异常增生;模型组小鼠14周末异型细胞累及全层下2/3，24周末可见癌细胞，核大、深染，可见病理性核分裂;24周末阳性对照组异型细胞大部分介于上皮全层的1/3-2/3;预防组14周末异型细胞不超过上皮全层的1/3，24周末组异型细胞累及上皮全层的1/3-2/3;治疗组24周末异型细胞大部分超过上皮全层的2/3，少部分介于上皮全层的1/3-2/3。 4透射电镜观察各组食管细胞的亚显微结构 模型组较正常组细胞间隙增宽，桥粒减少，细胞质水肿，染色质变异。阳性对照组、预防组、治疗组较模型组细胞间隙稍紧密，桥粒较多;预防组、治疗组较阳性对照组细胞间隙宽、桥粒少;预防组较治疗组细胞间隙紧密、桥粒丰富。 5免疫组化-SP法检测各组β-catenin、Wnt1、c-myc蛋白的表达 β-catenin蛋白在正常组表达量少且主要为胞膜着色，在模型组中大量蓄积于胞浆及胞核，表现为胞质及胞核呈棕黄色。Wnt1蛋白在正常组表达水平低，在模型组中堆积于细胞质，表现为细胞质呈棕黄色。C-myc蛋白在正常组表达水平低，在模型组主要表达于细胞核，少量表达于细胞质，表现为细胞核及细胞质呈棕黄色。β-catenin及c-myc在模型组表达水平明显高于正常组(P＜0.05);阳性对照组、治疗组、预防组明显低于模型组(P＜0.05);预防组与阳性对照组无明显差别（P＞0.05）;治疗组高于阳性对照组(P＜0.05);预防组明显低于治疗组（P＜0.05）。Wnt1在模型组表达水平明显高于正常组(P＜0.05);阳性对照组、治疗组、预防组明显低于模型组(P＜0.05);预防组、治疗组高于阳性对照组(P＜0.05);预防组与治疗组无明显差别（P＞0.05）。 6各组食管组织中β-catenin、Wnt1、c-myc基因的表达 各组总体RNA各等量利用Olig(dT)15锚定引物来进行逆转录，用β-catenin、Wnt1、c-myc引物对逆转录产物进行PCR扩增，分别出现192bp、623bp、263bp特异性扩增带。其中模型组的扩增带最亮，正常组最暗。阳性对照组、预防组、治疗组与模型组相比，扩增带较暗。β-catenin、Wnt1、c-mycmRNA的表达水平用目的基因扩增片断的积分吸光度与GAPDH扩增片断的积分吸光度的比值表示。经统计学分析显示:β-cateninmRNA/GAPDHmRNA、c-mycmRNA/GAPDHmRNA在模型组比值明显高于正常组(P＜0.05);阳性对照组、治疗组、预防组明显低于模型组(P＜0.05);预防组与阳性对照组无明显差别(P＞0.05);治疗组高于阳性对照组（P＜0.05）;预防组明显低于治疗组(P＜0.05)。Wnt1 mRNA/GAPDHmRNA在模型组比值明显高于正常组(P＜0.05);阳性对照组、治疗组、预防组明显低于模型组(P＜0.05);预防组、治疗组比值高于阳性对照组(P＜0.05);预防组与治疗组无明显差别(P＞0.05)。 结论: 14NQO为建立小鼠食管癌前病变动物模型的有效诱癌剂。 2随着食管病理损害程度的加重，Wnt通路相关蛋白β-catenin、Wnt1、c-myc表达升高。 3抑膈方能降低β-catenin、Wnt1和c-myc的表达，阻断食管癌的发生。预防用药具有明显优势。 4抑膈方阻断食管癌发生的机制可能是降低了Wnt通路相关蛋白β-catenin、Wnt1和c-myc的表达。