Asnodf32是由Natio等从紫云英中分离到的一个晚期结瘤素基因,编码一个根瘤特异表达的半胱氨酸蛋白酶。该基因在成熟的根瘤中表达量增加。原位杂交结果表明,它在过渡区和衰老区大量表达。因此,Natio等推测该基因编码的蛋白酶与根瘤的衰老有关。但是关于这一点并没有直接的实验证据来证明。为了验证Natio等推测的正确性以及深入阐明Asnodf32及其编码蛋白与根瘤衰老和固氮活性的关系,我们利用RNA沉默技术研究了该基因在根瘤衰老过程中的功能。同时建立了紫云英的组织培养体系及农杆菌转化体系。以转化了空载体的根瘤为对照,Real-time RT-PCR检测结果表明:在接种后30天、45天和60天的根瘤中Asnodf32均被有效沉默。无论是从共生效应还是根瘤内部特征来看,RNA沉默根瘤和对照根瘤都有所不同。从共生效应来看,比较接种后30天、45天和60天的RNA沉默根瘤和对照根瘤的数量以及长度发现:沉默根瘤的平均长度大于对照根瘤,特别是接种后60天二者之间的差异显著;用乙炔还原法测定了根瘤的固氮酶活,结果表明:在接种后60天,对照根瘤的固氮酶活与45天相比明显下降,而接种后60天的沉默根瘤的固氮酶活与45天相比,下降不明显。从根瘤内部特征来看,利用根瘤石蜡切片分析发现:接种后60天,80%以上的对照根瘤表现出较严重的衰老,而且该区已占据了根瘤体积的1/2左右。然而沉默根瘤却没有出现严重衰老现象;为了研究类菌体的衰老,我们利用TUNEL染色检测了根瘤细胞中DNA的断裂情况:在接种后60天的对照根瘤中,有半数以上的根瘤检测到了类菌体DNA的断裂,而沉默根瘤则没有检测到类菌体DNA的断裂。利用电镜进一步观察根瘤的超微结构变化,证明了60天的对照根瘤确实出现了严重衰老,相比之下,沉默根瘤大部分细胞维持正常形态,衰老细胞较少,只有少数细胞发生了程度较轻的衰老。由以上结果可知,Asnodf32的沉默延缓了根瘤的衰老,说明该基因及其编码蛋白AsNODF32在根瘤衰老的调节方面发挥着重要作用。很多半胱氨酸蛋白酶在胁迫条件下表达量增加,因此被认为参与了植物对胁迫的适应性反应。我们研究了野生型紫云英根瘤在NaCl、（NH₄）₂SO₄和黑暗胁迫条件下Asnodf32的表达情况,结果发现:80 mmol/L NaCl处理3天其表达量变化不大;而1 mmol/L（NH₄）₂SO₄处理3天,表达量增加了2.3倍;黑暗处理效果最显著,Asnodf32表达量增加了5倍。这一结果说明,该基因或其编码蛋白可能也参与了植物对胁迫的反应。