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目的:耐辐射球菌是一种对电离辐射、紫外线(UV)照射、干燥以及DNA损伤试剂都具有非常强的抗性,且不会引起自身致死或突变的奇特微生物。pprI基因是耐辐射球菌发挥辐射抗性、修复DNA损伤的关键调控基因,它作为一个分子开关,在受到电离辐射的刺激后上调表达,并可以通过调节recA和pprA的表达,来修复DNA损伤促进菌株的存活,此外pprI还可以调节耐辐射球菌的抗氧化、基因表达和代谢等能力,增强菌株的电离辐射抗性。本实验旨在研究耐辐射球菌pprI原核基因的真核表达载体的构建及其转染对离体真核细胞和哺乳动物急性放射损伤的防护作用。 材料与方法:以本室保存的pCMV-HA-pprI质粒为模板,利用PCR技术扩增目的基因,通过DNA重组技术构建了重组真核表达载体 pEGFP-c1-pprI,采用脂质体转染法转入人肺上皮细胞株(BEAS-2B),筛选稳转细胞以便观察其抗放作用。应用克隆形成实验检测受照细胞生存能力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;荧光显微镜观察受照细胞中ROS荧光强度;免疫荧光实验观察受照细胞不同时间点γH2A.x焦点数目。同时,将重组质粒pEGFP-c1-pprI通过活体电转染技术转入BALB/c小鼠股后肌中,转染后24 h给予4Gyγ射线照射,观察小鼠急性放射损伤的死亡率;观察小鼠照后1、7、14、28和35d小鼠外周血细胞数目和淋巴细胞百分率以及肺脏、小肠、睾丸等组织的病理变化;应用流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞、胸腺细胞和骨髓细胞凋亡率。 结果:成功构建了pprI原核基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达了PprI融合蛋白,将其转染到人肺上皮细胞系中,筛选出了稳定转染细胞系。辐射细胞生存曲线显示,与BEAS-2B细胞对照组和空载体转染组相比,转pprI基因的BEAS-2B细胞经不同剂量辐射,其细胞存活分数SF显著增加(P<0.05),该曲线参数D0、Dq、N值显著增高。转pprI基因BEAS-2B细胞受照后ROS荧光强度和不同时间γH2A.X的焦点数均显著减低(P<0.05);该细胞G2期阻滞和凋亡率显著减低(P<0.05)。γ射线照射后,pprI基因转染组小鼠死亡率显著低于单纯照射组和空载体转染组;由血象观察结果可见,pprI基因转染组小鼠外周血白细胞、血小板和淋巴细胞百分率显著高于单纯照射组和空载体转染组(P<0.05);由凋亡率检测结果可见,pprI基因转染组的小鼠的脾脏、胸腺、骨髓细胞的凋亡率显著低于单纯照射组和空载体转染组(P<0.05),与外周血的检测结果相对一致;由病理图片可见,pprI基因转染组小鼠组织脏器损伤较轻,恢复快于单纯照射组和空载体转染组。 结论: 1.成功构建了pprI原核基因的真核表达载体pEGFP-c1-pprI;pprI基因能够在真核细胞和哺乳动物体内表达PprI蛋白。 2.成功筛选pprI基因稳转细胞,pprI可降低受照细胞ROS含量,减少DNA双链断裂,进而降低细胞凋亡率并减少细胞周期阻滞,加快细胞的修复,提高细胞的生存力。 3.pprI基因活体转染可降低致死剂量受照小鼠的死亡率,显著减轻受照小鼠外周血细胞的下降程度,且可使淋巴细胞恢复提前。 4.pprI基因活体转染可以降低受照小鼠的脾脏、胸腺和骨髓细胞凋亡率。 5.pprI基因活体转染可减轻受照小鼠肺脏、肠道和睾丸的组织脏器的病理反应,加快受损组织的修复。 综上所述,pprI原核基因可在离体真核细胞和哺乳动物体内表达,对细胞和动物急性放射损伤具有显著的抗放作用。本研究为进一步阐明耐辐射球菌 pprI基因对受照真核细胞和哺乳动物的作用及其机制提供了有价值的资料。