【摘 要】
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麦角硫因是一种低分子硫醇,作为细胞氧化还原稳态的一种新兴因子得到人们的广泛关注。采用代谢工程手段建立可靠、实用的麦角硫因生产体系,实现麦角硫因的高效合成,势必促进其商业应用。本文以实验室已有的一株组氨酸高产大肠杆菌为出发菌株,利用系统代谢工程的理念和方法对其进行理性改造,逐步提高麦角硫因产量。主要研究内容如下:（1）在组氨酸高产菌株（HW1-5）中引入含耻垢分枝杆菌来源的麦角硫因合成相关基因的质粒
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麦角硫因是一种低分子硫醇,作为细胞氧化还原稳态的一种新兴因子得到人们的广泛关注。采用代谢工程手段建立可靠、实用的麦角硫因生产体系,实现麦角硫因的高效合成,势必促进其商业应用。本文以实验室已有的一株组氨酸高产大肠杆菌为出发菌株,利用系统代谢工程的理念和方法对其进行理性改造,逐步提高麦角硫因产量。主要研究内容如下:（1）在组氨酸高产菌株（HW1-5）中引入含耻垢分枝杆菌来源的麦角硫因合成相关基因的质粒p Trc99a-egt BCDEmsm和含粗糙脉胞菌来源的麦角硫因合成相关基因的质粒p Trc99-egt1ncr-Ptrc-egt Encr,得到菌株EGT1和EGT2。摇瓶结果显示菌株EGT1麦角硫因产量为9.23 mg/L,菌株EGT2的麦角硫因产量为5.94 mg/L。在组氨酸高产菌株（HW1-5）基因组上分别整合粗糙脉胞菌和耻垢分枝杆菌的麦角硫因合成相关基因,得到菌株EGT4和EGT5-2。摇瓶发酵结果显示菌株EGT5-2麦角硫因产量为11.1 mg/L的麦角硫因,菌株EGT4麦角硫因产量只有2.3 mg/L。表明耻垢分枝杆菌来源的麦角硫因合成途径可以在大肠杆菌中更加高效生产麦角硫因。（2）为了获得高效的麦角硫因合成途径,本文中采用逐步迭代设计-构建-测试的方式筛选来自不同物种的候选基因的各种组合。为避免代谢流阻滞引起有害中间产物积累文中按照谷氨酰半胱氨酸连接酶、C-S裂解酶、亚砜合酶、组氨酸甲基转移酶、酰基水解酶的顺序对麦角硫因合成支路依次进行优化。经验证得到整合大肠杆菌内源的谷氨酰半胱氨酸连接酶、粗糙脉胞菌来源的C-S裂解酶、耻垢分枝杆菌来源的亚砜合酶突变体、小球藻菌来源的组氨酸甲基化酶的菌株麦角硫因产量分别为18.6 mg/L、34.4 mg/L、64.5 mg/L、88.9 mg/L;相较于整合耻垢分枝杆菌来源相关酶的菌株的麦角硫因产量分别高47%、40.7%、7%、45%;过表达酰基水解酶的菌株麦角硫因产量较对照菌株相比提高14.5%。用以上基因重构出一条高效的麦角硫因合成途径构,构建得到菌株EGT33。（3）在菌株EGT33基础上,过表达大肠杆菌自身的腺苷蛋氨酸合酶突变体编码基因met KI303V,增强麦角硫因合成前体腺苷蛋氨酸的供应,得到菌株EGT40。摇瓶发酵结果显示,麦角硫因产量为240.7 mg/L,相较于菌株EGT33产量提高136.6%,菌体生长稍微变慢。表明腺苷蛋氨酸供应是麦角硫因的合成一个限制因素。（4）探究了外源甲基供体添加对麦角硫因合成的影响。结果显示,对于大肠杆菌合成麦角硫因,外源添加甲基供体时,蛋氨酸是更好的选择。（5）最后,利用5 L发酵罐对重组菌株EGT40进行分批补料发酵培养。发酵数据显示,该菌株经发酵罐培养52 h后,麦角硫因产量可达2.9 g/L,具有较强的大规模产业化应用潜力。
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