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研究背景慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia. CML)是常见的恶性血液疾病,费城染色体和Bcr-Abl融合基因的形成在其发病中发挥关键作用。伊马替尼(Imatinib)是CML特异性的分子靶向药物。虽然伊马替尼对部分CML患者(尤其是慢性期患者)具有很好的疗效,但伴随应用的积累和疾病的进展,仍然不可避免会出现伊马替尼耐药现象。研究表明伊马替尼的耐药除了Bcr-Abl相关的机制外,还与其他信号传导通路如NF-κB等信号通路的激活、多药耐药基因异常表达等因素相关。CUEDC2(CUE domain-containing2)是个新近报道的功能研究尚较少的蛋白,其特征是蛋白质结构中含有一个中度保守的泛素结合结构-CUE结构域,参与泛素蛋白酶体途径,促进蛋白质分子的泛素化与降解。研究发现CUEDC2除了在细胞周期、NF-κB信号通路的调节等生理过程中均能发挥重要作用,而且在乳腺癌、卵巢癌、肾癌等多种实体肿瘤中发现存在高表达；并且在乳腺癌中通过参与雌激素受体ER-α的泛素化降解过程影响乳腺癌的内分泌治疗敏感性。目前的研究已证实NF-κB作为重要的核转录因子在CML中处于异常活化状态,在CML发生发展及耐药等过程中均发挥重要的作用,但CUEDC2在CML中的表达情况和功能还未见报道,CUEDC2是否也参与了CML的发生、发展和耐药过程,以及其在CML中的作用机制是否和NF-κB信号通路相关,需要进一步研究探索。目的检测CUEDC2在CML患者骨髓标本及CML细胞系中的表达情况；以K562和耐伊马替尼的K562细胞K562/G01为研究对象,探究CUEDC2在CML细胞伊马替尼耐药中的作用及相关作用机制。方法1.收集2011年8月～2012年8月本院收治的58例CML患者及10例正常对照骨髓标本,分离单个核细胞,应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中CUEDC2基因的表达水平。2.应用实时定量PCR方法检测CML细胞系K562及耐伊马替尼的K562细胞系K562/G01中CUEDC2的表达水平。3.利用RNA干扰技术,构建靶向CUEDC2的特异性干扰载体,稳定转染K562细胞(CUEDC2高表达CML细胞系),下调细胞内的CUEDC2表达水平。采用MTT实验检测CUEDC2沉默对K562细胞生长增殖活性的影响,利用Hoechst染色、Annexin V-APC/PI双染及Western blot方法检测CUEDC2沉默对伊马替尼诱导细胞凋亡能力的影响。4.利用分子克隆技术构建CUEDC2-pIRES2表达质粒,并稳定转染K562/G01细胞(CUEDC2(?)(?)表达的CML细胞系),使其过表达CUEDC2。采用MTT实验检测过表达CUEDC2对K562/G01细胞生长增殖活性的影响,利用Hoechst染色、Annexin V-APC/PI双染及Western blot检测过表达CUEDC2对伊马替尼诱导细胞凋亡能力的影响。5. Western Blot方法检测上述干扰或过表达细胞及相应对照细胞中的NF-κB信号通路相关蛋白IKKα、IKKβ、IκBα的表达水平及IκBα、IKKα/β磷酸化水平的变化。免疫荧光法观察细胞内NF-κB p65蛋白核定位的情况,判断其入核活化状态。结果1.58例CML患者中CUEDC2的表达水平明显高于正常对照组,CUEDC2表达水平与CML患者年龄、性别无关,而与临床分期相关；慢性期患者骨髓细胞中CUEDC2的表达水平显著高于进展期(AP和BC期)患者,差异有统计学意义(P<0.05)。2.在CML细胞系K562细胞中CUEDC2mRNA的表达水平明显高于正常对照组(P<0.05)；K562细胞中的CUEDC2mRNA及蛋白表达水平均明显高于其耐伊马替尼细胞系K562/G01(P<0.05)。3.成功建立了利用shRNA干扰技术导致CUEDC2沉默的稳定K562细胞系K562-shl及K562-sh2。MTT实验结果显示CUEDC2沉默不影响K562细胞的生长增殖活性。凋亡实验结果显示CUEDC2沉默的K562-shl、K562-sh2细胞在伊马替尼处理后凋亡细胞比例较对照细胞组(K562-NC)明显下降,凋亡效应蛋白caspase-3的剪切活化形式较对照组细胞明显减少,表明CUEDC2沉默降低了K562细胞对伊马替尼的敏感性。4.成功构建了CUEDC2过表达质粒,并稳定转染K562/G01细胞。MTT实验结果显示过表达CUEDC2对K562/G01(?)田胞的生长增殖活性无明显影响。药物诱导的凋亡实验结果显示过表达CUEDC2的K562/G01经伊马替尼处理后凋亡细胞比例较对照组细胞明显上升,caspase-3的剪切活化形式较对照组细胞明显增加,表明CUEDC2过表达增强了K562/G01对伊马替尼的敏感性。5.对比K562和K562/G01细胞中NF-κB信号通路活性,发现K562细胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平较K562/G01低,NF-κB在K562细胞核中的定位也较K562/G01减少,IKKα、IKKβ的表达未见明显差异,结果提示K562/G01细胞中NF-κB信号通路的组成性活性强于K562细胞。6.检测CUEDC2沉默的K562细胞中的NF-κB (?)言号通路活性的结果显示,K562-sh1/sh2细胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平较对照细胞明显增高,NF-κB在细胞核内的的定位较对照细胞明显增加,而IKKα、IKKβ的表达和对照相比未见明显变化,表明CUEDC2沉默后K562(?)田胞中NF-κB信号通路活性增强；且当CUEDC2沉默的K562细胞经NF-KB特异性抑制剂Bay11-7082(IκB磷酸化抑制剂)处理后,IκBα的磷酸化水平降低,NF-κB在细胞核内的定位减少,NF-ΚB信号通路活性降低,对伊马替尼的敏感性增加。7.检测CUEDC2过表达的K562/G01细胞中的NF-κB信号通路活性的结果显示,过表达CUEDC2使K562/G01(?)田胞内的IKKα/β和IKBa蛋白的磷酸化水平较对照组细胞降低,NF-κB在细胞核内的定位也较对照组细胞减少,IKKα、IKKP的表达无明显变化,表明过表达CUEDC2降低了K562/G01细胞中的NF-ΚB信号通路活性。结论1.CML患者骨髓标本以及CML细胞系K562中存在CUEDC2的高表达,且CUEDC2的表达水平与CML患者临床分期有关,CUEDC2在慢性期CML患者中的表达水平明显高于进展期,此外,CUEDC2在敏感CML细胞系K562中的表达水平也显著高于伊马替尼耐药细胞系K562/G01。我们的上述研究结果首次明确了CML患者及细胞系中的CUEDC2表达情况,并且提示CUEDC2可能参与了CML的发生、发展以及伊马替尼耐药过程。2. CUEDC2表达能够负调控CML细胞的伊马替尼耐药水平,在CUEDC2高表达的K562中下调CUEDC2表达能够增加K562细胞对伊马替尼的耐药能力,而在CUEDC2(?)低表达的K562/G01中过表达CUEDC2则能够增加K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性,以上研究结果证实了CUEDC2表达参与CML细胞的伊马替尼耐药能力调节。此外,我们的研究还提示,NF-κB信号通路介导了CML细胞中CUEDC2对伊马替尼耐药能力的调节作用。本研究为探索CUEDC2在CML发生发展过程中的作用以及进一步阐明CML细胞的伊马替尼耐药机制奠定理论基础