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猪内源性反转录病毒感染人源细胞全基因克隆与序列分析中文摘要猪内源性反转录病毒(porcineendogenousretrovirus,PERV)是单股正链RNA病毒，以前病毒的形式整合在宿主基因组中。由于猪的心血管、消化、皮肤等系统与人类具有较大的相似性，一直是人类异种器官移植的首选供体。事实上，医生早已在使用猪的不同成分如心脏瓣膜、凝结因子、胰岛细胞治疗人类疾病。尽管据调查接受活猪组织的人体细胞未发现活性PERV感染的证据，但自从1997年Patience等发现PERV在体外可以感染多种人源细胞以来，猪→人异种移植的PERV安全性问题引起了人们广泛关注。
本实验是在建立的五指山小型猪(WZS)外周血(PBL)中的PERV感染人胚肾(HEK293)细胞感染模型的基础上，对PERV的存在进行鉴定并对其cDNA全基因进行克隆和序列分析，为进一步构建PERV感染性cDNA克隆，深入研究PERV对人源细胞的感染、整合、与调控机制奠定基础。依据猪内源性反转录病毒(PERV)WZS株全基因组序列，利用primer5.0软件设计合成了覆盖全长的5对重叠引物。其中5’端上游引物P1F中，在5’末端引入了病毒基因组中没有的SacI酶切位点和T7启动子核心序列，以便用T7RNA聚合酶进行体外转录。在5’末端还引入一个与病毒5’末端直接相连的外源G，提高转录效率，方便体外转录时完成5’端加帽反应。在3’端下游引物P5R中，为使全基因克隆转录体3’端具有感染性，在3’末端引入了30个腺苷酸(A)，同时在3’末端引入病毒基因组中没有的ClaI酶切位点，便于转录时将基因组克隆质粒线性化，使转录到该位点时，反应被人为终止，从而得到预期的病毒基因组RNA分子。培养PERV-WZS-293细胞，利用异硫胍酸盐方法制备总RNA，应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术加入反向引物，按SuperscriptⅢ反转录酶试剂盒说明书进行cDNA合成，以cDNA为模板利用5对重叠引物扩增出P1、P2、P3、P4及P5各cDNA重叠片段，运用RT-PCR技术获得覆盖全长PERV-WZS-293细胞全基因的5个DNA重叠片段，大小分别为1078bp、1817bp、2492bp、1766bp和2490bp。PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳纯化、回收，用T4DNALigase将PCR产物连接，其中P1、P2、P3用pGEM-Tvector，P4用pMD18-TVector，P5用pWSK29，然后将连接产物转化于DH5α感受态菌，利用蓝白斑筛选阳性重组子进行PCR及酶切鉴定，最后挑取阳性克隆测序。将PERV-WZS-293分5段相互重叠的片段利用基因组本身的酶切位点连接入低拷贝载体pWSK29中，得到了全长cDNA重组质粒命名为pWSK-PERV-WZS-293。对其序列及功能分析，为进一步构建PERV感染性cDNA克隆，建立筛选反转录病毒药物的细胞模型，深入研究PERV对人源细胞的感染、整合、与调控机制奠定基础。