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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，简称Hp)是目前发现的唯一能在人胃内定植、生存的细菌。已证实Hp感染是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因，与胃癌和胃MALT淋巴瘤的发病也有密切关系。目前，主要应用抗生素和质子泵抑制剂来治疗Hp感染，但广泛应用抗生素会导致耐药菌的不断增多，且价格昂贵，复发的机率也较大，不易被病人接受。因此，要在世界范围内完全根除Hp感染，唯一可行的方案是免疫接种，这就需要研制出一种安全有效的疫苗。 虽然Hp疫苗研究取得一定成绩，但一直令学者们遗憾的是每种抗原单独免疫动物时，获得的保护率均不是很高，而多种抗原联合免疫才能达到满意的效果，甚至高达100％，这就为今后Hp疫苗的研究指出了发展方向。 有研究表明尿素酶B亚单位(UreB)和热休克蛋白A亚单位(HspA)均可以刺激机体产生免疫应答且具有较好的免疫保护性，而且，HspA与尿素酶基因共表达时，尿素酶活性可增加4倍以上。 本研究选择Hp的两个保守性基因hspA基因和ureB基因，用PCR的方法获得这两个基因，并通过设计的合适的酶切位点，将它们以hspA-ureB的顺序插入原核表达载体中，构建表达Hp HspA-UreB融合蛋白的疫苗候选株，使之高效表达融合蛋白。通过免疫动物和Western blot方法研究HspA-UreB融合蛋白的免疫学活性，并通过亲和层析的方法纯化融合蛋白，为Hp联合抗原基因工程疫苗的研究奠定基础。 实验方法： 1．幽门螺杆菌hspA基因和ureB基因的克隆与序列分析郑州大学博士学位论文表达幽门螺杆菌HsPA·ureB融合蛋白的重组疫苗候选株构建及其免疫学活性研究 应用PCR的方法从本室临床分离的Hp MEL一HP27和国际标准HP NcTCI 1 637的染色体DNA中获得hapA基因和ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB 193中，转化大肠杆菌TBI，经氨节青霉素抗性和蓝白菌落筛选阳性克隆，用小提质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。对重组质粒进行基因序列测定，并通过OmigaZ.o软件进行序列分析和比较。 2 .Hp HsPA一ureB融合蛋白原核表达系统的筛选 从重组克隆质粒中纯化MEL一即27的hapA基因和和ureB基因片段，并以hspA一ureB的顺序融合插入温控表达载体pBVZ加、原核表达载体pMAL一CZx以及pET-30a中，转化合适的宿主大肠杆菌，经抗生素抗性和蓝白菌落筛选阳性克隆，小提质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。携带重组质粒的大肠杆菌经诱导，进行SDS一PAGE电泳，观察有无目的蛋白表达，并与HP(+)病人血清进行Westem blot分析，鉴定HsPA-UreB融合蛋白。 3 .Hp HspA一ureB融合蛋白的免疫学活性研究 利用生物学软件对MEL一HP27的HsPA一UreB融合蛋白的二级结构、空间构象以及抗原性进行模拟分析。通过皮下注射免疫小鼠获得融合蛋白的免疫血清，ELISA法检测血清效价。Westren blot方法检验融合蛋白的免疫学活性。 4.Hp HspA-ureB融合蛋白的纯化 利用镍离子柱亲和层析方法纯化HsPA一ureB融合蛋白，Westren blot法检测其免疫学活性。用纯化的融合蛋白包被酶标板，ELISA方法检测小鼠和人血清中Hp相应抗体。 结果与分析: 1.幽门螺杆菌hsPA基因和ureB基因的克隆与序列分析结果 (1)含hapA基因的重组质粒PNEB 1 93一hsPA(简称PNHA)，经双酶切后得到克隆载体片段(2.7 kb)和目的基因hsp^片段(0.35 kb)，特异peR可扩增出0.35 kb的hspA基因片段，证实HP hsPA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，hsPA基因全长357bP，编码由118个氨基酸残基组成的肤链，MEL一HP27和NCTC 1 1 637 hspA基因序列同源性为97.48%，编码氨基酸序列同源性为97.46%。MEL一HP27 hspA基因序列与GenBank公布的HP相应基因同源性高达95.20%一97.48%，氨基酸序列同源性在95.76%一97.46%之间。 (2)含ureB基因的重组质粒pNEB 1 93一ureB(简称PNuB)，经双酶切后得到克隆郑州大学博士学位论文表达幽门螺杆菌HsPA·UreB融合蛋白的重组疫苗候选株构建及其免疫学活性研究载体片段(2.7 kb)和目的基因ureB片段(1.7 kb)，特异PCR可扩增出1.7kb的ureB基因片段，证实Hp ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，ureB基因全长1 7 1 obP，编码由569个氨基酸残基组成的肤链，MEL一HP27和NCTC 1 1 637 ureB基因序列同源性为97.67%，氨基酸序列同源性为99.47%。MEL一HP27 ureB基因序列与GenBank公布的Hp相应基因序列同源性高达%.08%一98.30%，氨基酸序列同源性98.77%一99.82%。 2 .Hp HsPA一ureB融合蛋白原核表达系统的筛选结果 成功构建了三个表达HP HsPA一UreB融合蛋白的原核表达系统，即带有重组质粒pBV220一hspA一ureB的大肠杆菌DH5a(简称DH5a(pBV-HU27))、带有重组质粒pMAL一CZx一hspA一ureB的大肠杆菌TBI(简称TBI印MHU27))和带有重组质粒pET30a-hspA一ureB的的大肠杆菌BL21(DE3)(简称BLZI(pET-HU27))。 DH5a印Bv-HU27)经42oC诱导，76.5切a的HspA一UreB融合蛋白在全菌蛋白中的含量为6%，可溶性分析发现融合蛋白以包涵体形式存在，纯化效果不理想。