本文为了研究骨髓基质细胞(MSCs)在体内外条件下增殖和分化的特点，通过动物实验比较了MSCs在体外的不同分离培养方法和诱导分化为神经细胞的不同条件，观察了体外培养扩增的MSCs通过侧脑室移植到新生大鼠HIE模型后，移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况。研究工作分为两个实验： 实验一： 研究目的：研究体外扩增培养MSCs的不同方法及诱导分化为神经细胞的条件，并对分化细胞进行形态学和免疫细胞化学鉴定。 研究方法：用无菌注射器吸取DMEM冲洗幼年SD大鼠四肢骨的骨髓腔，将收集的冲洗液通过密度梯度离心分离出单核细胞，然后分别接种到A组：DMEM/10％FBS(含bFGF和EGF)培养基和B组：DMEM/10％FBS(不含bFGF和EGF)培养基的培养瓶中进行培养，每2-3d更换一次培养液以去除非黏附细胞。 研究结果：通过倒置显微镜观察原代培养的细胞呈贴壁生长，梭形或扁平状，伸出突起。A组培养至7-9d左右有分化的神经细胞出现，免疫组化表达NSE(52±9.2)％和GFAP(15±7)％，分化细胞继续培养可存活7d以上。B组则培养到15d左右细胞融合，用0.25％胰蛋白酶消化传代，将第2代的MSCs先用DMEM/10％FBS/1mmol/Lβ-巯基乙醇(BME)预诱导24h，再用DMEM/5mmol/LBME诱导，1h后细胞形态发生明显变化，胞体收缩，伸出细小突起，6h时细胞突起延长，互相连接成网状，呈神经元样细胞形态，表达NSE(71±8.8)％，分化细胞24h后逐渐死亡； 研究结论：A组(加bFGF和EGF)培养基的细胞增殖效能明显高于B组(未加bFGF和EGF)，P＜0.05，有统计学意义。MSCs在A组条件下培养可分化为神经元样细胞，表达NSE(52±9.2)％和GFAP(15±7)％，分化细胞存活达7d以上。 实验二： 研究目的：将用A组方法培养扩增的MSCs通过侧脑室移植到新生大鼠HIE模型脑内，观察MSCs在脑内的存活、迁移、分化情况。 研究方法：移植前48h用BrdU标记MSCs。建立出生后7d(P7)新生SD大鼠HIBD模型，即将新生大鼠乙醚麻醉后，结扎左颈总动脉造成一侧脑缺血，1h后在密闭有机玻璃舱内呼吸8％O2和92％N2的条件下缺氧2h造成HIE，并分为4组处理：①HIBD模型对照组(HIBD后未予任何处理)；②MSCs移植组(HIBD后将BrdU标记的MSCs4×103/2μl注射到左侧侧脑室内)；③生理盐水对照组(HIBD后将生理盐水2μl注射到左侧侧脑室内)；④正常对照组(未予任何处理)。分别在移植后7d、14d、21d等不同时间点用4％多聚甲醛心脏灌注后取鼠脑制作组织切片，通过光镜、透射电镜(TEM)、免疫荧光和免疫组化等方法观察移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况。 研究结果：正常对照组的脑组织结构正常，MSCs移植组移植后7dHE染色可见脑组织结构层次欠清晰，细胞轻度水肿，有少量胶质细胞增生，与HIE对照组、生理盐水对照组相比，无明显差异。14d时各组的脑组织结构基本正常；通过透射电镜(TEM)观察HIBD模型对照组和MSCs移植组的海马神经元细胞超微结构，发现前组的细胞内线粒体肿胀、空泡化，少量胶质细胞增生，后组的细胞结构正常，有较多的小胶质细胞，可见含有丰富细胞器的原始分化细胞，类似神经细胞。免疫荧光染色可见BrdU(+)细胞左侧海马区。移植后7dBrdU(+)细胞(184±66)主要分布在左侧侧脑室附近的室管膜下区(SVZ)；14d时在右侧脑白质可以见到，但多数BrdU(+)细胞(82±39)分布在左侧海马区、SVZ，呈灶状分布，少数散在分布在皮层。21d时BrdU(+)细胞(37±5)较前减少。BrdU(+)细胞中70％表达GFAP(+)，5％表达NSE(+)。 研究结论：MSCs侧脑室移植后可在新生大鼠HIBD脑内存活、迁移、分化。 小结：在体外用常规细胞培养基加神经生长因子bFGF和EGF较为满意地扩增培养了大鼠MSCs，并诱导MSCs分化为神经元样细胞，NSE和GFAP阳性表达分别达(52±9.2)％和(15±7)％。将MSCs用BrdU标记后，经侧脑室注射到新生SD大鼠HIBD模型脑内，在不同的时间点通过光镜、TEM、免疫荧光、免疫组化等方法观察到：移植到脑内的MSCs可以存活，并从侧脑室迁移到SVZ、海马区和皮层，甚至从损伤侧(左侧)迁移到了对侧，分化为神经元样细胞。