经典名方中药复方制剂的开发是中药行业的一个重要方向。但是在经典名方的开发研究中碰到很多共性关键问题亟待解决,如饮片炮制问题。由于炮制方法演变、炮制设备的更新和中医药理论的不断发展,遵古考证结果和现代临床应用形式大多存在很大差异性。“炙甘草”是主要炮制问题中最有代表性的。“炙甘草”从汉代以炒甘草为主逐步发展到现代以“蜜炙甘草”为主,这个演变过程致使经典名方中“炙甘草”炮制形式的选择陷入困境。为厘清甘草不同炮制品的异同点,为真正做到“遵古而不泥古”提供科学依据,促进经典名方复方制剂的高质量开发。本研究以成分与药效为指标,开展了甘草不同炮制品的差异性比较,并基于药效筛选甘草指标/活性成分,从辅料蜂蜜的天然低共熔溶液（Natural deep eutectic solvents,NADES）的角度探讨甘草蜜炙增效的原理。研究目的 厘清“炒甘草”、“蘸水炒甘草”、“蜜炙甘草”的物质基础和药理作用的异同点及其产生原因,于化学物质组成和主要药效两方面科学回答不同“炙甘草”的异同点,为甘草不同炮制品的合理选择提供科学依据,为经典名方“炙甘草”的正确选择提供现代科学依据。研究方法对 “炙甘草”进行炮制方式的文献考证、传统功效、甘草的化学成分与药理作用以及蜂蜜的天然低共熔溶液的特征4方面进行阐述。甘草传统的炮制形式主要有3种:“清炒”、“蘸水炒”、“蜜炙”,甘草的传统功效与免疫调节、抗炎作用关系密切,现代药理研究表明甘草具有显著的保肝作用。辅料蜂蜜是一种天然低共熔溶液（NADES）,具有提高成分的溶解度、提取率、稳定性和体内吸收等优势作用。因此,该论文以蜂蜜的NADES特性为重要切入点,研究“炒甘草”、“蘸水炒甘草”、“蜜炙甘草”化学成分和药理活性的差异,揭示三者的差异。具体开展如下研究:1.化学成分的分析:采用紫外-可见分光光度法检测总多糖和总黄酮的含量差异,采用基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的代谢组学分析方法对生甘草、炒甘草、蘸水炒甘草、蜜炙甘草以及NADES炙甘草水煎液进行整体化学轮廓比较,并找出引起组间差异的主要成分。采用基于UHPLC-QqQ-MS的定量分析技术对检测出有显著差异的成分和甘草中公认的活性成分（甘草酸、甘草苷）进行靶标定量分析。2.活性成分药代动力学分析:采用UHPLC-QqQ-MS对甘草不同炮制品组小鼠血浆中活性成分的浓度进行定量分析,明确不同炮制方式对甘草活性成分生物利用度的影响差异。在生甘草水煎液中加入蜂蜜或NADES,验证蜂蜜对甘草活性成分的促吸收作用。3.药理活性分析:比较生甘草、炒甘草、蜜炙甘草以及NADES炙甘草在免疫调节活性、抗炎活性以及保肝作用方面的差异。①复制脾虚动物模型比较甘草的补脾益气功效,并进行肠道菌群测定分析。②复制急性炎症模型,测定耳肿胀度及耳肿胀抑制率。③复制CCL4致急性肝损伤小鼠模型,测定肝指数、血清及肝脏中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的水平。4.药效-成分的关联分析:将上述组间差异成分的含量数据构建“化学成分”数据集,药理指标数据构建“药效活性”数据集,通过SPSS-22.0进行相关性分析和回归分析,寻找与药理功效指标高度相关的化学成分,这些成分即为甘草不同效应的活性成分。并监测连续给药多天后小鼠血浆中以上活性成分的蓄积浓度。5.甘草蜜炙机理探究:以上所有实验均设置NADES炙甘草作为对照组,采用FT-IR检测蜂蜜以及NADES与甘草活性成分在分子层面上的相互作用。研究结果与讨论 生甘草（R）、炒甘草（F）、蘸水炒甘草（W）、蜜炙甘草（H）以及NADES炙甘草（N）中W和F组中总多糖及总黄酮的含量基本一致,H和N组中的含量基本一致,且H组的含量高于F组的含量。代谢组学研究表明W和F的化学组成基本一致,H和N的化学组成基本一致,共鉴定出46种组间差异成分。包括21种黄酮类成分,8种皂苷类成分,9种小分子糖及其衍生物成分,8种其他化合物。其中18种化合物（包括黄酮类、皂苷类、小分子糖及其衍生物类）靶标定量分析表明甘草经不同炮制方式处理后,黄酮类、皂苷类和小分子糖类成分的含量有显著性变化。二氢黄酮类成分（甘草苷,芹糖甘草苷,甘草素,6"-O-乙酰甘草苷,6"-O-乙酰芹糖甘草苷）的含量降低,而查尔酮类成分（芹糖异甘草苷,异甘草苷,6"-O-乙酰芹糖异甘草苷,6"-O-乙酰异甘草苷）的含量升高,推断炮制过程中甘草中的化学成分可能发生了异构化反应以及苷键断裂反应,而蜂蜜的加入具有抑制由于热加工导致的化学成分的转化,从而起到稳定甘草中化合物的作用。药代动力学研究表明,甘草蜜炙后芹糖甘草苷、甘草素和甘草次酸的体内暴露量均显著性增加,且蜜炙甘草组甘草苷和甘草素的药时曲线表现出双峰现象。在水煎液中加入蜂蜜或NADES后,芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素以及甘草次酸的生物利用度均增加,提示蜂蜜作为NADES可以促进活性化合物的吸收。药效学研究表明,与生甘草相比,蜜炙甘草可以显著性提高小鼠的廓清指数、脾指数及胸腺指数,通过增强巨噬细胞吞噬能力,改善脾脏和胸腺功能,增强甘草的免疫调节活性;而清炒甘草和生甘草没有差异。肠道菌群实验结果表明与生甘草和炒甘草相比,蜜炙甘草可以明显逆转脾虚小鼠肠道菌群稳态失衡的病理状态,降低致病菌群的丰度。抗炎实验表明,蜜炙甘草可以显著性抑制由巴豆油导致的小鼠耳肿胀。肝损伤实验结果表明,与生甘草相比,清炒甘草与蜜炙甘草均可以降低由CCL4引起的血清和肝脏中ALT、AST水平的异常增高,并降低肝肿胀度;尤其是蜜炙甘草的效果更加明显,且强于炒甘草。基于药效-成分的相关分析结果表明,免疫调节活性与甘草次酸显著性正相关,与乙酰类化合物（22β-乙酰甘草酸、6"-O-乙酰芹糖甘草苷、6"-O-乙酰甘草苷）、甘草皂苷B和甘草素显著性负相关。甘草次酸可能是发挥抗炎作用、保肝作用的主要活性成分,同时异甘草苷可能同样与保肝活性正相关,而甘草皂苷B、甘草苷以及乙酰类化合物（22β-乙酰甘草酸、6"-O-乙酰芹糖甘草苷和6"-O-乙酰甘草苷）与保肝活性负相关。连续给药7天后,H/N组中甘草苷、甘草素、异甘草苷以及甘草次酸的体内暴露量均增加,甘草酸在H/N组中蓄积浓度显著性下降,但是甘草苷的增加无统计学意义。提示甘草次酸、甘草素以及异甘草苷可能是蜜炙甘草药理活性提升的关键性成分。以上所有实验结果显示蜜炙甘草与NADES炙甘草没有显著性差异,提示蜜炙甘草增效主要与蜂蜜的NADES部分有关。蜂蜜的NADES部分具有提高药效成分的提取率、增强加热炮制过程中药效成分的稳定性、促进药效成分的体内吸收,提高其生物活性的作用。基于FT-IR分析结果显示蜂蜜/NADES与活性成分之间存在多重相互作用力,该作用可能是蜂蜜/NADES提高甘草中活性成分的提取率、稳定性以及生物利用度的重要原因。本课题研究表明历史上存在的蘸水炒甘草与炒甘草没有区别,炒甘草和蜜炙甘草具有不同的药理活性和不同的药效物质基础,临床上二者应区分使用。就免疫调节功能,抗炎及保肝方面宜选用蜜炙甘草。蜜炙甘草增效的机理可能与蜂蜜的NADES特性有关。