基于Tn5转座子的AcMNPV突变体库的构建和初步分析

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本文以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,首次应用基于Tn5随机转座子的方法,构建杆状病毒突变体库。Tn5是来源于细菌的转座子。在Tn5转座酶作用下,通过两个19bp的重复序列,可以带动重复序列之间的基因随机插入到基因组DNA中。大片段基因序列插入会破坏原有基因组结构和功能,带来表型改变。   本文将果蝇hsp70启动子带动表达绿色荧光蛋白插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体,利用体外转座系统将转座子随即插入AcMNPV基因组,转染Sf细胞后,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库。   从突变体库中纯化了两株病毒A66G和A79G,用PCR、SouthernBlot等正式转座子已经成功插入,且各插入了一个拷贝。病毒复制动态的比较分析发现A79G出芽型病毒的产生明显快于野生型病毒和A66G.。还用单引物PCR技术对转座子的插入位点进行了初步的分析,但确切位点还有待最后确定。   本研究建立了基于转座子的杆状病毒突变体库的建立方法。在进一步完善突变病毒的分析方法,特别是转座子插入位点的确定,必要基因被破坏的突变病毒株的分离等的基础上,这一方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。   
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