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背景和目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的重要并发症,也是最常见的导致终末期肾脏疾病(End-stage renal disease,ESRD)的病因之一。其主要病理特征为肾脏结构改变包括肾小球肥大、系膜基质增厚、肾小球足细胞损伤,导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。这些变化共同导致了进行性蛋白尿增多和肾小球滤过率减少,最后发展为终末期肾病。糖尿病肾病的发病机制目前并不完全清楚,研究表明高血压、高血糖、晚期糖基化终末产物、脂质代谢异常、脂肪堆积、促纤维化生长因子、炎症因子、氧化应激等在糖尿病肾病进展中发挥一定的作用。法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)属于核受体超家族成员,是一种细胞内信号蛋白,作为多功能转录调节因子激活或抑制靶基因表达。FXR在肝脏、肠、肾上腺和肾脏等组织都有高表达。现有研究表明FXR在糖尿病肾病发生发展中发挥重要作用,可能与FXR参与调控糖脂代谢基因表达有关,但具体调控机制仍不清楚。visfatin是新近分离并鉴定的一种分泌型蛋白,亦称前B细胞克隆增强因子(pre-B cell colony ehancing factor,PBEF),在脂肪组织、肝脏、心脏、骨骼肌、脑、肾脏等组织中均有表达。研究发现visfatin在糖脂代谢、胰岛素抵抗、细胞增殖、分化、凋亡和炎症反应等过程中发挥重要作用。研究发现visfatin在糖尿病患者血清浓度明显升高,参与了调控炎症因子表达、内皮功能损伤、胰岛素抵抗及动脉粥样硬化等。体外研究亦发现visfatin在高糖诱导肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞表达显著升高,外源性visfatin可促进肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白GLUT-1的表达上调,促进葡萄糖吸收,并刺激促纤维化基因表达。我们前期研究发现血清visfatin水平在糖尿病肾病患者明显升高,且与炎症因子呈正相关,与肾功能水平呈显著负相关,提示visfatin很可能与糖尿病肾病的进程及炎症状态有密切相关。本研究拟通过体内体外实验阐明FXR调控visfatin表达的分子机制及其在糖尿病肾病进展过程中的作用,为深入认识糖尿病肾病发病机制提供新的思路。方法:1.临床研究部分:收集2014年6月-2015年12月我科收治经肾活检确诊的2型糖尿病肾病患者的肾活检标本及临床资料,并根据病理分期分为早期DN组13例、中期DN组16例、晚期DN组18例;收集我院泌尿外科同期收治的10例肾肿瘤手术患者远离肿瘤组织的正常组织标本为对照组;对收集的肾组织标本行PAS及visfatin免疫组化染色;患者临床资料收集包括年龄、性别、24小时尿白蛋白、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN),并根据Cockcroft-Grault公式计算肾小球滤过率(e GFR)。并对分析统计结果进行如下比较:(1)比较各组24小时尿白蛋白、Scr、BUN、e GFR及visfatin表达半定量结果;(2)选取各期DN组患者24小时尿蛋白、Scr、BUN、e GFR结果,与visfatin表达半定量结果进行相关性分析。2.细胞实验部分:(1)采用FXR激动剂GW4064、FXR拮抗剂Guggulsterone处理人肾小球系膜细胞HMC,Real-time PCR和Western blot检测visfatin的m RNA及蛋白表达变化;(2)分别给予高糖(HG)诱导HMC转染si RNA沉默visfatin、GW4064或外源性visfatin处理:(1)Real-time PCR检测visfatin的m RNA表达,Western blot检测visfatin、NF-κB、IκBα的蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清MCP-1浓度;(2)Real-time PCR检测TGF-β1、α-SMA、Collagen IV及FN的的m RNA表达水平,Western blot检测TGF-β1、smad2/3、p-smad2/3、α-SMA、Collagen IV及FN的蛋白表达水平;(3)cck-8法检测系膜细胞增殖,Real-time PCR和Western blot检测增殖相关基因PCNA的m RNA和蛋白表达水平;(3)根据生物信息学预测结果构建全长及截短visfatin启动子双荧光素酶报告基因载体:(1)将全长荧光素酶载体转染至高糖诱导系膜细胞,给予不同浓度的GW4064(0.5μM,1μM,5μM)或溶剂DMSO处理,24小时后检测visfatin启动子活性;(2)将FXR表达质粒和截短visfatin启动子双荧光素酶报告基因载体共转染至293细胞,给予DMSO或GW4064(5μM)处理,24小时后检测visfatin启动子活性。3.动物实验部分:采用db/db小鼠作为糖尿病肾病动物模型,db/m小鼠作为对照,将db/db小鼠分为db/db(12w)组、db/db(16w)组、db/db(20w)组及db/db(20w)+GW4064治疗组:(1)检测各组小鼠血糖、体重、24小时尿白蛋白、Scr、BUN等生化指标;(2)取各组小鼠肾脏组织行PAS、Masson染色,进行visfatin、TGF-β1、α-SMA及FN免疫组化染色;(3)Western blot检测各组小鼠肾脏组织visfatin、NF-κB、IκBα、TGF-β1、smad2/3、p-smad2/3、α-SMA、Collagen IV及FN的蛋白表达情况。结果:1.临床研究部分:(1)免疫组化染色结果显示visfatin在DN患者肾脏组织表达,主要定位于肾小球,肾小管间质少量表达,且visfatin表达强度随着DN的分期增加表达增强(P<0.01,与对照组比较)。(2)在早、中期DN组,visfatin表达与患者24小时尿白蛋白、Scr、BUN水平呈正相关(R=0.868,P<0.01;R=0.913,P<0.01;R=0.938,P<0.01),与患者e GFR呈负相关(R=-0.979,P<0.01);在晚期DN组,visfatin表达与患者24小时尿蛋白呈负相关(R=-0.499,P<0.05),与Scr、BUN及e GFR水平无相关性(R=-0.099,P>0.05;R=0.281,P>0.05;R=0.026,P>0.05)。2.细胞实验部分:(1)激活FXR通过调控visfatin表达可以抑制高糖诱导系膜细胞增殖及增殖相关基因、炎症因子、促纤维化基因的表达:与对照组比,HG组细胞增殖显著增快(P<0.01),GW4064组较HG组增殖速度显著下降(P<0.01),GW4064组PCNA蛋白表达水平较HG组显著下降(P<0.01);与GW4064组比,GW4064+visfatin组细胞增殖、PCNA表达显著回升(P<0.01);(2)与对照组比,HG组p-P65蛋白表达、细胞上清MCP-1水平明显升高(P<0.01),而IκBα蛋白表达显著下降(P<0.01);与HG组比,GW4064组p-P65和MCP-1表达水平显著下调(P<0.01),IκBα表达明显回升(P<0.01);与GW4064组比,visfatin组p-P65蛋白表达、上清MCP-1水平显著上调(P<0.01),而IκBα表达明显下降(P<0.01);(3)与对照组比,HG组TGF-β1、p-smad2/3、α-SMA、Collagen IV及FN的m RNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01),GW4064组较HG组的TGF-β1、p-smad2/3、α-SMA、Collagen IV及FN的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.01);与GW4064组比,GW4064+visfatin组TGF-β1、p-smad2/3、α-SMA、Collagen IV及FN的m RNA和蛋白表达水平明显回升(P<0.01);(4)双荧光素酶实验结果显示,与对照比,HG组visfatin启动子活性显著增强,给予FXR激动剂GW4064可以抑制visfatin启动子活性,并呈浓度依赖性,其中GW4064(1μM)、GW4064(5μM)与HG组比具有统计学意义(P<0.01);截短实验结果显示visfatin启动子活性在1607bp-1192bp之间明显增强(P<0.01),提示FXR与visfatin启动子能的结合位点为visfatin启动子1607bp-1192bp区域。3.动物实验部分:(1)与db/m组比,db/db组小鼠24小时尿白蛋白、Scr、BUN显著升高(P<0.01),且随着周龄增加而逐渐升高;GW4064治疗组小鼠24小时尿白蛋白、Scr、BUN较db/db组显著下降(与16w及20w比,P<0.01);(2)PAS及Masson染色显示db/db小鼠肾小球明显增大,球囊扩展,糖原沉积,系膜及基质增生,肾小球细胞外基质增多,而GW4064治疗组肾小球的上述改变明显减轻;免疫组化染色显示,visfatin主要表达于肾小球,肾小管间质有少量表达,db/db组小鼠visfatin表达随着小鼠周龄增加逐渐增强,GW4064治疗组表达明显下降,TGF-β1、α-SMA和FN的免疫组化染色结果显示其趋势同visfatin免疫组化染色;(3)Western blot结果显示,与db/m组比,db/db组visfatin蛋白表达显著升高,且随着周龄增加而逐渐升高(P<0.01),p-P65、TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA、Collagen IV和FN表达趋势同visfatin表达(P<0.01,与db/m组比);GW4064组visfatin蛋白表达较db/db组显著下降(与16w及20w比,P<0.01);p-P65、TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA、Collagen IV和FN的表达也明显下调(与16w及20w比,P<0.01),而IκBα表达趋势与visfatin表达相反(与16w及20w比,P<0.01)。结论:激活FXR通过调控visfatin基因启动子转录活性下调其表达,从而抑制系膜细胞增殖、炎症因子及促纤维化因子的表达,延缓糖尿病肾病的进展;其可能的结合位点位于visfatin启动子-1607bp至-1192bp区域。