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目的为了探讨糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein,GITR)在免疫相关性疾病发生发展中的作用,寻找可能的免疫干预途径。本文克隆了小鼠GITR(mGITR)全长；构建了带有小鼠IgGFc(mIgGFc)的mGITR胞外段(mGITR胞外段-mlgGFc)及单独mGITR胞外段的两种原核表达质粒,并进行相关融合蛋白(mGITR及mGITR-Fc)的表达和纯化；检测了两种融合蛋白的体外生物学活性；观察nGITR-Fc融合蛋白对小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的影响并分析其可能机制。旨在为GITR的应用研究奠定理论依据和试验基础。方法(1)通过RT-PCR法从小鼠脾脏细胞中扩增获得mGITR基因全长,克隆至pMD18-T载体后,转化E.coli DH5α宿主菌,挑取菌落验证并取阳性菌落进行测序分析。利用网络平台和生物信息学软件,对mGITR蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析。(2)应用PCR法扩增出带有合适酶切位点的mGITR胞外段基因和mIgGFc段基因,将其分别克隆至pMD18-T载体后进行测序分析；再经酶切和连接,分别将mGITR胞外段基因单独或与mIgGFc段基因联合转移至pET32a(+)原核表达载体。(3)将带有目的基因的两种原核表达载体分别转化E.coli Rosetta宿主菌,获得两种带有His的原核蛋白,并分别用镍柱进行纯化,然后经Western Blot鉴定。(4)采用MACS磁珠分选技术,分离纯化小鼠脾脏CD4+T细胞,将CD4+T细胞接种96孔细胞培养板进行培养,在每孔中加入相同浓度的mGITRL和不同浓度的mGITR或mGITR-Fc融合蛋白,3H-TdR掺入法检测mGITR胞外段或mGITR胞外段-Fc融合蛋白对]mGITRL刺激CD4+T细胞增殖的影响。应用mGITR-Fc融合蛋白作用树突状细胞,观察该蛋白对树突状细胞表面GITRL分子表达的影响。(5)构建小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎模型。利用mGITR-Fc融合蛋白干预该模型后,通过HE染色、流式细胞术等方法检测其干预效果。结果(1)成功获得载有小鼠GITR全长基因的重组载体并经测序正确,命名为pMD18-T-mGITR。生物信息学分析显示小鼠GITR蛋白胞外区具有较高的可及性,柔韧性及亲水性等,GITR蛋白胞外区的这些特性为进一步表达该蛋白,以及研究其功能奠定了基础。(2)成功获得携带mGITR胞外段或mGITR胞外段-mIgGFc基因片段的表达载体,经测序验证,分别命名为pET32a-mGITR胞外段和pET32a-mGITR胞外段.-mIgGFc。(3)经原核表达并进行蛋白纯化,获得带有His标签的mGITR胞外段和mGITR胞外段-Fc重组蛋白,并经SDS及Western Blot鉴定。(4)可溶性]mGITR和mGITR-Fc融合蛋白,能够通过与mGITRL的结合,阻断其作用于CD4+T细胞表面的GITR,从而抑制mGITRL刺激的CD4+T细胞增殖,其抑制作用呈浓度依赖性。此外,体外实验还表明,应用mGITR-Fc融合蛋白体外作用树突状细胞,可见树突状细胞表面GITRL分子表达下调。(5)成功建立了小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎模型。应用这一动物模型的实验表明,本研究制备的mGITR-Fc融合蛋白能够延缓实验性自身免疫性甲状腺炎的进一步发展,表现为蛋白干预后可见病变组织中炎性细胞浸润减少、血清中mTgAb水平明显下降等。结论成功克隆了小鼠GITR全长及其胞外段基因；构建了pET32a-mGITR胞外段、pET32a-mGITR胞外段-mIgGFc两种表达载体；经原核表达成功获得mGITR和nGITR-Fc融合蛋白。原核表达的mGITR和nGITR-Fc融合蛋白能够阻断mGITRL刺激CD4+T细胞而使其增殖降低,该作用与GITR/GITRL共刺激信号相关；mGITR-Fc蛋白能使D2SC/1细胞表面的mGITRL表达下调,该作用与反向信号通路相关。体内试验研究表明,mGITR-Fc融合蛋白能够延缓小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的发生发展。