【摘 要】
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矮牵牛的常规育种通常利用杂交、自交和回交等方式,但操作较复杂、耗时长,聚合多个性状,如品质、抗性等,周期更长或较难实现。近来开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统具有操作简便、对目标位点精准编辑等优点,在农作物和观赏植物基因功能研究以及育种领域具有很好的发展潜力和应用前景。在矮牵牛中,花色、花期、株型、抗逆性等性状决定着其品质,是育种的主要目标。本论文在矮牵牛中建立了基于CRISPR/Cas9的
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矮牵牛的常规育种通常利用杂交、自交和回交等方式,但操作较复杂、耗时长,聚合多个性状,如品质、抗性等,周期更长或较难实现。近来开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统具有操作简便、对目标位点精准编辑等优点,在农作物和观赏植物基因功能研究以及育种领域具有很好的发展潜力和应用前景。在矮牵牛中,花色、花期、株型、抗逆性等性状决定着其品质,是育种的主要目标。本论文在矮牵牛中建立了基于CRISPR/Cas9的单基因敲除、多基因敲除和单碱基编辑系统,并对矮牵牛中PhPDS基因及抗性、开花期、花色等性状相关基因PhMLO、Ph TFL1a、Ph TFL1b、Ph TFL1c、Ph TFL1d、Ph TCPs、Ph ALS进行了编辑,为矮牵牛基因编辑育种和基因功能研究提供了重要材料。本论文的研究结果如下:1.矮牵牛基因编辑体系的建立:优化和选择矮牵牛基因编辑载体,在矮牵牛品种W115中确定了PhPDS、Ph TFL1a、Ph TFL1b、Ph TFL1c、Ph TFL1d、Ph TCPs和Ph ALS的靶位点序列,在此基础上构建了CRISPR-PhPDS和CRISPR-PhMLO单基因敲除载体、CRISPR-Ph TFL1a-Ph TFL1b-Ph TFL1c-Ph TFL1d四个基因敲除载体、CRISPR-PhTCPs十敲表达载体和PhALS-CBENG碱基编辑载体。2.矮牵牛遗传转化体系的优化:通过农杆菌介导的转化方法,以叶盘为外植体转化矮牵牛。通过可视化RUBY系统进行遗传转化体系优化,优化条件后阳性转化效率为90.66%。3.靶位点编辑效率及基因编辑材料的表型观察:单基因敲除载体敲除PhPDS基因,获得了白色愈伤的效率为86.57%;敲除PhMLO家族基因的效率为58.33%。利用多基因敲除载体同时敲除Ph TFL1家族基因TFL1a-Ph TFL1b-Ph TFL1c-Ph TFL1d 4个基因,获得了阳性植株72株,基因编辑植株43株,编辑效率为59.72%;同时时敲除Ph TCP家族10个同源基因,获得阳性植株20株,其中基因编辑植株14株,编辑效率在65%。Phtfl1a-Phtfl1b-Phtfl1c-Phtfl1d的突变株系,表现为早花,并且分支增多。同时也对PhMLO编辑株系进行了抗白粉病分析。本工作建立了矮牵牛中成熟的基因编辑体系,为矮牵牛基因功能研究和性状改良提供了基础。
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