论文部分内容阅读
目的:糖尿病患者发生脑血管并发症的几率较正常血糖患者高2-4倍,但其具体机制尚不清楚。近年来大量研究表明,无论Ⅰ型还是Ⅱ型糖尿病病人,其血清中醛固酮(Methylglyoxal, MGO)的含量均升高,而这可能与糖尿病血管并发症的发生发展有关。研究发现,MGO拥有比葡萄糖高200-50000倍的糖基化活性,其可通过DNA修饰及细胞凋亡系统的激活两条途径发挥细胞毒作用造成细胞损伤。另有研究发现,在糖尿病发病机制中,自噬(Autophagy)可激活并清除内皮细胞内的已破裂线粒体,由此发挥保护作用。它被广泛认为是一种细胞再利用细胞质、清除胞内有害及缺陷结构的过程。但是,最近研究发现自噬是一把细胞自我保护及自我杀伤的双刃剑,大部分学者认为,其在损伤轻微时,自噬被激活以清除有毒介质及破损的细胞器;而当损伤超过一定临界值,自噬诱导细胞死亡。那么,在糖尿病脑血管病的发病过程中自噬究竟扮演怎样的角色,其作用的机制是什么,目前还不是很清楚。有研究发现,在肿瘤细胞中黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)信号通路被强烈抑制的情况下,细胞能通过增强自噬信号得以存活;又有研究表明诱导自噬能抑制FAK表达信号,提示自噬与FAK信号通路的相关性,那么在非糖尿病脑血管病中,自噬是否与FAK信号通路有关,目前还不知道。方法:1、采用人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein vascular endothelial cells, HUVECs)行离体实验。使用MGO模拟糖尿病高糖环境,确认MGO对HUVECs的高糖损伤,并研究自噬在其损过程中的表达变化。2、采用HUVECs行离体实验。使用雷帕霉素(Rapamycin,自噬激动剂)诱导自噬活化水平升高、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,自噬抑制剂)抑制自噬通路,并观察其对MGO所引起细胞高糖损伤的干预作用。3、采用HUVECs行离体实验。使用PF573228(FAK通路抑制剂)抑制FAK磷酸化,同时观察其对MGO作用期间自噬表达变化的影响,以及细胞活性的改变。4、采用HUVECs行离体实验。在MGO模拟的高糖损伤实验后,进一步进行氧糖剥夺实验(Oxygen and glucose deprivation, OGD)模拟缺血环境,研究高糖对缺血诱导的细胞损伤的影响,并同时给予Rapamycin或3-MA或PF573228干预,研究自噬在MGO诱导增强的OGD损伤中的作用,及其与FAK通路的相关性。5、采用雄性Sprague Dawley (SD)大鼠行在体实验。使用链脲霉素(STZ)诱导1型糖尿病,并在造模成功后进一步进行右侧永久性大脑中动脉栓塞(Permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)手术,研究糖尿病对大鼠脑缺血时行为学、脑梗死面积及血脑屏障功能损伤的影响,以及缺血早期的自噬在脑皮层内皮细胞中的表达变化。6、采用Ⅰ型糖尿病造模成功的雄性SD大鼠行在体实验。在pMCAO手术前给予右侧脑室注射Rapamycin干预,研究自噬对糖尿病大鼠脑缺血时血脑屏障功能的影响。结果:1、MGO对HUVECs造成的细胞损伤呈MGO剂量依赖,并诱导自噬表达在损伤早期快速上升。2、Rapamycin可诱导LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达比值增高,提示自噬活化水平升高,在MGO诱导的HUVECs损伤中起到了保护作用。3、PF573228可抑制LC3-Ⅱ转化提示自噬通路被阻,并进一步恶化MGO诱导的HUVECs损伤。4、MGO显著恶化OGD诱导的HUVECs损伤。在MGO连续OGD(MGO/OGD)损伤体系中,Rapamycin干预显著提高了HUVECs活性,3-MA和PF573228使HUVECs活性进一步降低。5、Ⅰ型糖尿病SD大鼠pMCAO术后行为学评分显著降低、脑梗死面积显著增加、血脑屏障通透性显著提高,自噬标记蛋白Beclin-1在pMCAO早期脑皮层内皮细胞中表达显著增多。6、右侧脑室注射Rapamycin干预后显著改善了Ⅰ型糖尿病SD大鼠的血脑屏障通透性。结论:本论文首先采用离体人类脐静脉内皮细胞株(HUVECs),通过Western Blot方法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白含量比值,证实了自噬在MGO诱导的糖尿病细胞损伤早期呈高表达;其次通过Rapamycin或3-MA药物干预自噬表达,证明自噬对MGO损伤造成的HUVECs细胞活性下降具有保护作用;接着,再通过PF573228阻断FAK磷酸化,证明了以上过程可能与FAK信号通路有关;进一步在MGO诱导加重的OGD损伤中,用同样方法证明了自噬对HUVECs活性具有保护作用,并可能与FAK信号通路有关。进一步在1型糖尿病雄性SD大鼠pMCAO模型中,糖尿病加重大鼠脑缺血时神经功能下降、脑梗死面积增加,并加重了脑内皮功能的损伤。在糖尿病脑缺血早期自噬蛋白Beclin-1于皮层呈高表达,并对脑血管内皮功能起保护作用,与离体实验一致。因此,本研究中体外和体内证明了自噬在糖尿病脑缺血引起的血管内皮细胞损伤中起保护作用,这可能与FAK磷酸化有关。