背景上世纪以来,心血管疾病已成为危害人类健康的“头号杀手”。动脉粥样硬化斑块破裂继发血栓形成是急性心血管事件发生的主要原因之一。研究易损斑块的特征对于早期发现和治疗,预防急性心血管事件的发生有重要意义。组织弹性作为人体组织的一种生物力学参数,受病理和生理过程影响最大。从生物力学角度来看,在相同的应力作用下,斑块所能承受的压力临界值越低,该斑块被认为更易损。该压力临界值在很大程度上均取决于斑块自身的弹性力学特性。斑块的弹性大小可以通过斑块在承受相同应力作用下所发生形变大小得以反映。在相同应力下,斑块发生形变越小,说明斑块的弹性越小,所能承受的压力临界值越大,该斑块更稳定；反之则斑块更易损。即通过测量斑块的形变(应变)可以反映斑块的弹性,进而评价斑块的稳定性。这也是本研究应用剪切应变和面积应变评价斑块力学稳定性的理论依据。在血管内超声基础上发展起来的血管内超声弹性成像(intravascular ultrasound elastography, IVUSE)是一种评价斑块弹性力学属性的新技术。运用该技术研究发现,脂质斑块比纤维斑块应变大。斑块的力学属性与多种因素有关,比如斑块的组织成分、几何形态、负荷以及边缘条件等。本实验组前期应用自研的血管内超声弹性成像软件证实斑块的组织成分与斑块的弹性力学属性之间存在相关关系,同时也证明该软件在分析斑块弹性力学特性方面的可靠性。目前,一些研究发现斑块的几何形态与斑块的稳定性有关,但是这些发现多为一些前瞻性的观察性研究,且结论不一致,其机制也缺乏充分的阐释。本研究旨在应用IVUSE技术研究不同形态学特点的动脉粥样硬化斑块的弹性力学特征,从弹性力学角度解释易损斑块形态学特征的机制。目的1、采用IVUSE技术评价斑块形态学特征对斑块弹性力学特性的影响。2、从弹性力学角度解释动脉粥样硬化斑块易损的形态学特征。方法1、动物模型选择雄性纯种新西兰兔30只,在高脂饲料(1%胆固醇)喂养2周后,进行腹主动脉球囊拉伤术,以造成腹主动脉血管内皮的损伤。术后给予青霉素肌注预防感染。所有动物全程高脂饲料喂养到第12周结束。2、血管内超声检查在建立的动脉粥样硬化兔模型中,于第12周末进行腹主动脉IVUS检查。首先于兔腹主动脉内获得匀速回撤(0.5mm/s)的连续血管内超声图像,然后每只动物选择两个等回声斑块(相距不少于1cm),采集不少于3个心动周期的原位血管内超声图像,以DICOM格式保存并进行脱机分析。通过勾画IVUS腹主动脉全程扫描图像和斑块原位图像中腹主动脉内膜和外膜边界可以确定动脉粥样硬化斑块的轮廓。计算血管外弹力膜面积(EEMarea)、血管腔面积(Lumenerea)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)、血管外弹力膜体积(EEMvolume)、血管腔体积(Lumenvolume)、斑块体积(PV)、斑块体积负荷(PVB)、斑块最小厚度(PTmin)、斑块最大厚度(PTmax)、斑块偏心指数(EI)和血管重构指数(RI)。3、血管内超声弹性图构建通过自研的VIVI软件对血管内、外膜边界半自动描绘和跟踪,在内外膜之间的斑块区域通过“块匹配”的搜索算法寻找变形前后两帧IVUS图像上匹配度最高的点,然后计算出该点的应变和各个方向分量,从而得到斑块的剪切应变(SS)和面积应变(AS)。4、分组1)根据偏心性分组：偏心斑块组：EI>0.5；向心斑块组：EI<0.5。2)根据偏心的程度分组：偏心斑块Ⅰ组：EI>0.75；偏心斑块Ⅱ组：0.5<EI≤0.75。3)根据斑块大小分组：低负荷斑块组：PB≤40%；高负荷斑块组：PB>40%。4)根据重构类型分组：负性重构组：RI<0.95；无重构组：0.95<RI<1.05；正性重构组：RI>1.05。5、统计学分析应用SPSS190统计软件进行统计分析。正态分布的数值变量采用均数±标准差表示,非正态分布的数值变量采用中位数(四分位数间距)表示。数值变量的正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。方差齐性检验采用Levene检验。两组间比较采用独立样本的t检验、t’检验或Mann-Whitney U检验。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANO VA)或Kruskal-Wallis检验。斑块和血管的形态学指标与斑块的弹性力学指标之间的关系采用逐步多元线性回归分析。p<0.05认为有统计学意义(非参数检验两两比较,p<0.017认为有统计学意义)。结果K IVUS图像获取结果30只新西兰兔在喂养过程中死亡5只,25只存活的新西兰兔中有两个斑块的超声图像质量较差无法准确分析,最终获得48个动脉粥样硬化斑块较清晰的IVUS图像,斑块均为较均匀的等回声斑块。2、偏心斑块与向心斑块弹性力学差异偏心斑块(n=37)的PA、PB、PVCTmin明显小于向心斑块(n=11)(p<0.05),而EI、SS和AS显著大于向心斑块(p<0.05)。3、不同偏心程度的偏心斑块弹性力学特征偏心斑块Ⅰ组(n=23)的的PA、PB、PV、PVB、Tmin和Tmax小于偏心斑块Ⅱ组(n=14)(p<0.05),EI和SS明显大于偏心斑块Ⅱ组(p<0.05)；偏心斑块Ⅰ组的PA、PB、PV、PVB和Tmin小于向心斑块组(n=11) (p<0.05),EI、SS和AS大于向心斑块组(p<0.05)；偏心斑块Ⅱ组除Tmin和EI(p<0.05)外其他指标与向心斑块组无统计学差异。偏心斑块Ⅱ组的AS大小介于偏心斑块Ⅰ组和向心斑块组之间,但与二者均无统计学差异。4、斑块负荷与斑块弹性力学特性的关系低负荷组斑块(n=22) PA、PV、PB、PVB、Tmin和Tmax均小于高负荷组(n=26)(p<0.05),而Lumenarea、Lumenvoiume和EI均大于高负荷组(p<0.05),SS和AS组间无统计学差异。偏心斑块Ⅰ低负荷亚组(n=17)的Lumenerea、Lumenvolume明显大于高负荷亚组(n=6)(p<0.05),PA.PB.PVB和Tmax,以及斑块的SS和AS均明显小于高负荷亚组(p<0.05)；因为偏心斑块Ⅱ组和向心斑块组继续分组后,亚组例数太少而未能统计分析。5、血管重构对斑块弹性力学特性的影响负性重构组(n=10)、正性重构组(n=21)和无重构组(Ⅱ=17)三组的重构指数存在显著性差异(p<0.001)。负性重构组的SS和AS明显大于无重构组(p<0.05)。6、斑块弹性力学属性的影响因素逐步多元线性回归分析显示斑块PB和EI对SS和AS有影响,且EI对SS和AS的影响更大。回归方程分别为：9=-5.119+6.330x1+8.929x2(5):SS；x1:EI；x2:PB), R2=0.365,F=12.928,df=47,p=0.000； 9=-7.677+10.050x1+14.157x2(9:AS；x1:EI； x2:PB),R2=0.359,F=12.616,df=47,p=0.000。回归模型的参数估计各项均有统计学意义(p<0.01)。结论1该研究发现斑块形态学特征与应变之间的关系,偏心斑块较向心斑块、高负荷斑块较低负荷斑块、血管发生负性重构处的斑块较无重构处斑块的应变更高。2斑块的偏心指数和斑块负荷可用于预测斑块的弹性力学稳定性,其中偏心指数对斑块的弹性力学稳定性影响更大。背景他汀类药物因具有降脂以及抗炎的作用而成为当前临床用于抗动脉粥样硬化的主要药物之一。研究表明,瑞舒伐他汀(rosuvastatin)作为强效的他汀类药物不仅能减缓动脉粥样硬化进展,还能缩小斑块的体积,减少炎症反应。然而,决定急性心血管事件发生的因素并不单单只有斑块的大小或血管的狭窄程度,还有斑块的易损性。易损斑块的破裂继发血栓形成是急性心血管事件的主要原因之一。因此,对于斑块易损的识别与治疗对预防急性心血管事件有重要意义。斑块易损性的特点包括大的脂质池、薄纤维帽、炎症细胞多、平滑肌细胞少。因此,单纯的形态学特征不能满足对瑞舒伐他汀稳定斑块效果的评价。一项准确的功能学检测技术用于评价斑块易损性成为科研与临床的共同需求。血管内超声弹性成像技术(IVUSE)能评价斑块的弹性力学特征,许多研究将这一技术用于易损斑块的识别。我们前期的研究也显示斑块的弹性力学特征与斑块组织成分具有良好的相关关系。但是,目前瑞舒伐他汀对动脉粥样硬化斑块力学特性的影响尚不明确,本研究拟采用IVUSE技术评价瑞舒伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块力学特性的影响。目的1、采用IVUSE技术评价瑞舒伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块力学特性的影响。2、明确瑞舒伐他汀影响动脉粥样硬化斑块力学特性的机制。方法1、动物模型20只纯种雄性新西兰兔高脂饮食(1%胆固醇)喂养两周后行腹主动脉内膜球囊剥脱术(球囊导管4.0×15 mm)。在第13周,家兔随机分为2组(n=10)治疗组将瑞舒伐他汀(15mg/kg/day)溶解于生理盐水中灌胃治疗8周；对照组用相同的方法给予同等体积的生理盐水8周。整个过程持续给予高脂饮食喂养。第20周结束,处死动物,切取腹主动脉。2、血清学检测于治疗前和处死前,取兔耳缘静脉空腹血样。4000 rpm 8分钟离心后收集上清液。用全自动临床生化分析仪测定血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。3、IVUS检查和常规IVUS参数测量在处理前后,采用40 MHz血管内超声探头(帧频30/s)和iLab IVUS系统行兔腹主动脉IVUS检查,每只动物采集图像包括腹主动脉全程扫描和2个感兴趣斑块的原位动态图像(不少于3个心动周期)。通过勾画IVUS腹主动脉全程扫描图像和斑块原位图像中腹主动脉内膜和外膜边界可以确定动脉粥样硬化斑块的轮廓。计算血管外弹力膜面积(EEMarea)、血管腔面积(Lumenaarea)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)、血管外弹力膜体积(EEMvolume)、血管腔体积(Lumenvolume)、斑块体积(PV)、斑块体积负荷(PVB)斑块最小厚度(Tmin)、斑块最大厚度(Tmax)、偏心指数(EI)和血管重构指数(RI)。4、IVUS弹性图构建和力学参数测量采用自研的软件系统从感兴趣斑块的原位图像中,选取舒张末期连续的两帧图像分别作为斑块变形前和变形后的图像构建IVUS弹性图,计算斑块剪切应变(SS)和面积应变(AS)。在血管内超声弹性图上通过勾画偏心斑块的肩部和体部,分别测量斑块局部的SS和AS。5、组织病理学和免疫组织化学处死动物后,用生理盐水和10%林格甲醛溶液灌注固定。根据血管内超声检查过程中记录的位置截取腹主动脉并用10%林格甲醛溶液浸泡48小时,然后将每段腹主动脉分为两个部分。一部分冰冻、包埋并切成6μm的连续切片做油红O染色,另一部分用石蜡包埋,切割成4gm的连续切片做苦味酸-天狼星红染色和免疫组化染色。计算斑块内胶原纤维、脂质、平滑肌细胞(SMC)和巨噬细胞的含量和斑块易损指数(VI)；计算斑块内MCP-1,MMP-2和TNF-α含量。6、TUNEL染色兔腹主动脉主动脉浸泡于10%林格甲醛溶液中48小时后石蜡包埋,切成4μm的连续切片。根据说明使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测斑块中阳性细胞数目。细胞凋亡率采用5个高倍视野(×400)下TUNEL阳性细胞数与总细胞数比值表示。7、统计分析统计分析采用IBM SPSS 19.0。所有服从正态分布的定量变量用均数±标准差表示,不服从正态分布的定量变量用中位数(四分位数间距)表示。定量变量的正态性检验用Shapiro-Wilk检验。方差齐性检验用Levene检验。配对设计的连续变量的差异性检验采用t检验或Wlcoxon检验。组间比较根据数据分布情况采用t检验,t’检验或Mann-Whitney U检验。Pearson双变量相关分析用于检验SS和AS与斑块组分和易损指数的相关性。p<0.05为有统计学意义。结果1.一般情况和斑块的形态学特征5只兔子在实验过程中死亡,1只兔子因超声图像质量差而剔除。最后,共获得14只兔子的完整数据,瑞舒伐他汀组和对照组各7只。瑞舒伐他汀治疗降低了血清TC和LDL-C(p<0.05)；对照组的血清TC和LDL-C水平随时间增高(p<0.05)。两组血清TC和LDL-C治疗前后的差值有统计学差异(p<0.05)(表1)。瑞舒伐他汀组的EEMarea、Lumenarea、EEMvolume 和 Lumenvolume治疗后较治疗前显著减小(p<0.05)；对照组斑块的PA、PB、PV、PVB和EEMvolume随时间增加(p<0.05)。两组的EEMarea、Lumenarea、EEMvolume、Lumenvolume、 PA、PV和PVB治疗前后的差值有统计学差异(p<0.05)。瑞舒伐他汀组表现为负性重构,而对照组略为正性重构,重构指数组间有显著差异(p<0.001)。2、斑块力学性能瑞舒伐他汀组14个斑块整体的SS和AS、11个偏心斑块的整体、肩部和体部的SS和AS在治疗前后无明显变化(P>0.05)；对照组14个斑块整体的SS和AS,9个偏心斑块的整体和肩部的SS和AS均显著增加(p<0.05)。组间比较,斑块整体SS和AS以及偏心斑块整体和肩部的SS和AS治疗前后的差值均有统计学差异(p<0.05)。第20周末对照组偏心斑块的肩部SS和AS比体部增大(p<0.05)3、斑块组织成分与对照组比较,瑞舒伐他汀组斑块胶原纤维较多,巨噬细胞和脂质较少(p<0.05)。平滑肌细胞组间无统计学差异。与对照组相比,瑞舒伐他汀组易损指数(VI)显著降低(p<0.01)。4、炎性因子水平及细胞凋亡的组间差异对照组斑块MCP-1, MMP-2和TNF-a的表达明显高于瑞舒伐他汀治疗组(p<0.05)。免疫组化染色显示MMP-2主要位于斑块增厚的内膜层,尤其集中于斑块肩部的纤维帽下。与对照组比较,瑞舒伐他汀治疗后的动脉粥样硬化斑块的细胞凋亡率明显降低(p<0.05)5、SS和AS与斑块成分和VI之间的相关性SS与胶原纤维和SMC含量呈中度负相关,与巨噬细胞浸润程度、脂质含量以及VI均呈中度正相关(p<0.05)。AS与胶原含量、SMC含量、巨噬细胞浸润程度、脂质含量和Ⅵ表现出与上述相似的相关性(p<0.05)。SS与TNF-α水平和细胞凋亡率均呈中度正相关(p<0.05),AS与TNF-a水平和细胞凋亡率也表现出中度正相关(p<0.05)。结论1、在兔动脉粥样硬化模型中,瑞舒伐他汀治疗通过改变斑块组织和分子成分使其力学特性趋于稳定。2、进展期偏心斑块的肩部较体部表现出更不稳定的力学特性。瑞舒伐他汀能有效控制偏心斑块肩部的剪切应变和面积应变。3、斑块力学属性的差异与斑块成分、炎症和细胞凋亡状态有关。研究证实IVUSE可用于观察药物引起的兔动脉粥样硬化斑块力学属性的变化。