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[目 的]不同部位脂肪组织分泌的细胞因子具有差异性,内脏脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT)比皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)高分泌白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)。但IL-8生物效应的发挥依赖于其特异性受体CXCR1/2,近年来研究发现CXCR2与代谢性疾病关系更为密切。本文旨在通过RNA干扰技术,探究不同部位脂肪组织诱导下肝细胞CXCR2表达情况对胰岛素信号传导的影响。[方 法]首先,应用荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)的方法检测人肝癌HepG2细胞中CXCR2表达情况并筛选出可用于后续实验的CXCR2特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。其次,对不同部位脂肪组织作用下的人肝癌HepG2细胞CXCR2表达情况进行qPCR检测,并进一步验证在不同部位脂肪组织诱导下CXCR2-siRNA、CXCR2-过表达质粒转染的HepG2细胞中CXCR2表达情况,从而证实CXCR2干扰效果。再次,通过Transwell小室将不同部位脂肪组织与干预了 CXCR2表达的HepG2细胞进行共培养,检测各实验组上清液中的LDH活性。最后,收集基础条件下和胰岛素刺激下的各共培养组中肝癌HepG2细胞,用蛋白质印迹法(Western blot,WB)方法检测肝细胞胰岛素信号传导通路IRS2/PI3K/Akt2关键蛋白IRS2、p-IRS2(S731)、PI3K-p85、Akt2、p-Akt2(S473)的表达情况。[结 果](一)、CXCR2特异性小干扰片段的筛选结果:(1)HepG2细胞表达CXCR2;(2)与siRNA2、siRNA3相比,siRNA1能显著降低HepG2细胞的CXCR2表达。(二)、不同部位脂肪组织共培养条件下HepG2细胞CXCR2表达验证结果:(1)与HepG2组相比,不同部位脂肪组织作用下的HepG2细胞中CXCR2表达水平均明显升高;(2)HepG2+SAT组与HepG2+VAT组相比,后者HepG2细胞中CXCR2表达升高更显著;(3)与脂肪组织作用下的HepG2细胞相比,脂肪组织作用下转染CXCR2-siRNA的HepG2细胞,其CXCR2表达水平明显降低,而脂肪组织作用下转染CXCR2-过表达质粒的HepG2细胞,其CXCR2表达水平明显升高;(4)与HepG2&CXCR2 plasmid+SAT组相比,HepG2&CXCR2plasmid+VAT组的CXCR2表达水平显著升高。(三)、不同部位脂肪组织共培养条件下HepG2细胞上清液中LDH活性结果:(1)与HepG2组相比,不同部位脂肪组织作用下的HepG2细胞上清液LDH水平均升高;(2)HepG2+SAT组与HepG2+VAT组相比,后者上清液中LDH活性升高更明显;(3)与脂肪组织共培养的HepG2细胞相比,脂肪组织作用下转染CXCR2-siRNA的HepG2细胞,其上清液中LDH活性减低。而脂肪组织作用下转染CXCR2-过表达质粒的HepG2细胞,其上清液中LDH活性升高。(四)、CXCR2表达情况对肝胰岛素信号通路IRS2/PI3K/AKt2关键蛋白的影响:(1)与HepG2组相比,不同部位脂肪组织作用下的HepG2细胞中IRS2、PI3K-p85、p-Akt2(S473)蛋白表达均降低,而p-IRS2(S731)蛋白表达升高,且VAT比SAT效果显著;(2)在基础状态下或胰岛素刺激下,与脂肪组织作用下的HepG2细胞相比,脂肪组织作用下转染 CXCR2-siRNA 的 HepG2 细胞,其 IRS2、PI3K-p85、p-Akt2(S473)蛋白表达水平升高,而p-IRS2(S731)蛋白表达水平减低;(3)在基础状态下或胰岛素刺激下,与脂肪组织作用下的HepG2细胞相比,脂肪组织作用下转染CXCR2-过表达质粒的HepG2细胞,其IRS2、PI3K-p85、p-Akt2(S473)蛋白表达水平降低,而p-IRS2(S731)蛋白表达水平升高;(4)HepG2组、不同部位脂肪组织作用下的HepG2组以及不同部位脂肪组织作用下干预CXCR2表达的HepG2组之间Akt2蛋白表达水平无统计学差异。[结 论](1)HepG2 细胞表达 CXCR2。(2)CXCR2-siRNA1 沉默 HepG2细胞的CXCR2效果最佳。(3)不同部位脂肪组织均可上调肝细胞CXCR2表达水平,且VAT 比SAT更能促进肝细胞CXCR2表达。(4)CXCR2-siRNA及CXCR2-过表达质粒干扰HepG2细胞CXCR2的表达有效。(5)肝细胞CXCR2表达的上调与VAT之间可能存在正向反馈激活机制。(6)VAT、SAT及CXCR2表达情况均能在一定程度上影响肝细胞的存活。(7)不同部位的脂肪组织对肝细胞胰岛素信号传导均存在影响,其中VAT比SAT更能抑制肝胰岛素信号传导通路IRS2、PI3K-p85、p-Akt2(S473)蛋白的表达,且促进p-IRS2(S731)蛋白表达。(8)CXCR2负向调控脂肪组织作用下的肝细胞IRS2、PI3K-p85、p-Akt2(S473)蛋白表达,提示CXCR2是脂肪组织介导肝细胞胰岛素抵抗的重要参与者,脂肪组织诱导肝细胞CXCR2表达的增强可能干扰了肝细胞胰岛素信号通路的正常传导。(9)CXCR2正向调控脂肪组织作用下的肝细胞p-IRS2(S731)蛋白表达,p-IRS2(S731)蛋白可能是脂肪组织诱导肝细胞胰岛素抵抗的参与者。(10)不同部位脂肪组织诱导肝细胞胰岛素抵抗的发生机制可能与Akt2蛋白无关,且未提示CXCR2能够影响肝细胞Akt2蛋白表达。