目的:胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤之一,其发生率约占中枢神经系统恶性肿瘤的80%左右。当前,胶质瘤的治疗仍然以手术切除为主,辅以放射治疗和化学治疗。近年来,针对胶质瘤早期诊断,手术根治以及放化疗等方面已经取得了一定的进展。然而胶质瘤具有高侵袭性,且抗放射和化学治疗的特点,患者的预后情况不容乐观,中位生存期不足1年。胶质瘤的恶性发展是一个涉及多步骤,多阶段以及多基因的复杂病理过程,基因治疗是当前研究的热点问题。深入研究胶质瘤的致病机制,寻找和鉴定关键的基因靶点,可为胶质瘤临床诊断和治疗提供必要的科学依据。TRIMs（Tripartite Motif）家族蛋白拥有三个典型的结构域,包括锌指结构域,B-box结构域以及卷曲螺旋结构域。TRIMs家族蛋白多数成员具有E3泛素连接酶活性,参与细胞中多种生物学过程,包括转录调控,信号传导,细胞增殖,分化,凋亡,器官发育,免疫应答,自噬以及肿瘤生成。TRIM66是TRIMs家族的成员之一,具有潜在的转录抑制因子功能。TRIM66已经被报道在多种恶性肿瘤中发挥肿瘤蛋白的功效,包括肝细胞癌,前列腺癌,肠癌,非小细胞肺癌以及骨肉瘤等。然而TRIM66在胶质瘤中的表达模式以及生物学功效尚未明确。在本研究中,我们将探讨TRIM66在胶质瘤中的表达模式,临床病理意义,生物学作用以及潜在的分子生物学机制。研究方法:1.免疫组织化学95例脑神经胶质瘤组织取自于2013-2019年在中国医科大学附属第四医院行胶质瘤手术切除的患者。获取的石蜡组织制备4μm切片,经过脱蜡,水化,抗原修复,抗体孵育,显色。结合染色强度和百分数评估TRIM66在胶质瘤组织中的表达水平。2.生物信息学分析收集Oncomine（https://www.oncomine.org/resource/login.html）数据库中胶质瘤以及正常脑组织中TRIM66 mRNA的表达数据,统计分析肿瘤组织及正常组织中TRIM66的表达差异。收集TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中,胶质瘤患者TRIM66 mRNA表达数据以及患者的总生存期,分析TRIM66的表达水平与患者总生存期之间的相关性。3.细胞培养,转染以及干扰本实验所用到的细胞系为人正常星形胶质细胞SVG p12以及脑神经胶质瘤细胞系A172,U87MG,U251。培养细胞用到含10%胎牛血清的DMEM和EMEM培养基。细胞培养条件为37℃,5%CO2,饱和湿度。pCMV6-TRIM66质粒以及pCMV6-empty阴性对照空载质粒转染于U251细胞中,转染试剂为Lipofectamine3000。TRIM66 si RNA以及non-targeing si RNA阴性对照转染于A172细胞中,转染试剂为Dharmafect1。转染或者干扰后,收集细胞通过western blot以及实时荧光定量PCR检测转染及干扰效率,并应用于细胞增殖,侵袭,周期,凋亡等细胞功能实验。4.Western blot提取细胞样本的总蛋白,经过SDS-PAGE分离,转印于PVDF膜。PVDF膜经过漂洗,非特异性封闭后,进行目标抗体孵育。本实验所用一抗为TRIM66,GAPDH,MYC,GLUT3。所用二抗为辣根过氧化物酶耦合二抗。将PVDF膜置于凝胶成像系统暗室中进行曝光,获取蛋白条带图片。5.实时荧光定量PCR使用RNAiso试剂提取细胞样本的总RNA,并检测RNA样本的浓度及纯度。以RNA样本为模板,使用Rrime Script RT Kit反转录获取cDNA;以cDNA为模板,使用SYBR Select Master Mix Kit进行目的基因扩增。目的基因的相对表达量依据2-ΔΔCt方法进行估测,内参基因为GAPDH。6.细胞增殖,侵袭,周期实验将TRIM66过表达及TRIM66沉默的脑神经胶质瘤细胞系分别应用于CCK8实验,集落形成实验,Transwell侵袭实验,PI单染实验中分析TRIM66表达差异对细胞行为的影响。CCK8:细胞接种于96孔培养板中,连续培养1,2,3,4,5天,酶标仪检测细胞的吸光度值,分析TRIM66表达差异对细胞增殖率产生的影响。集落形成实验:细胞接种于培养皿中,连续培养14天,显微镜下对细胞集落进行计数,分析TRIM66表达差异对细胞集落形成能力产生的影响。Tranwell侵袭实验:Transwell上室接种细胞并加入无血清培养基,下室加入含10%胎牛血清培养基,对穿过基质胶进入下室的细胞进行计数,分析TRIM66表达差异对细胞侵袭能力产生的影响。周期实验:细胞培养过后,进行PI染色,并通过流式细胞仪分析细胞周期变化。7.替莫唑胺抗性实验将经过TRIM66过表达和沉默的脑神经胶质瘤细胞系,进行替莫唑胺凋亡诱导处理。分别进行Annexin V/PI双染及JC-1染色处理,通过流式细胞仪分析胶质瘤细胞的凋亡水平变化以及线粒体膜电位变化。8.葡萄糖代谢实验葡萄糖获取实验:收集TRIM66过表达和沉默的脑神经胶质瘤细胞系,加入2-NBDG荧光素溶液,37℃恒温孵育30分钟,通过流式细胞仪分析细胞中荧光强度的变化。葡萄糖消耗实验:收集TRIM66过表达和沉默细胞的上清液,根据Glucose Oxidase Assay Kit试剂盒说明书处理细胞,通过酶标仪检测荧光强度变化。ATP含量水平测定:收集细胞,与ATP Assay Buffer混合均匀。在96孔板中加入ATP反应液,然后每孔中加入细胞混合液,37℃恒温孵育,通过酶标仪检测荧光强度变化。9.染色质免疫沉淀实验将脑神经胶质瘤细胞用甲醛溶液进行处理并通过超声波破碎,获取300-1000bp的DNA片段。将获取的DNA-蛋白质复合物用MYC以及Ig G抗体进行孵育。纯化富集的DNA片段,并进行q PCR进行荧光信号采集。10.统计分析本实验获得的数据通过SPSS 22.0软件进行分析。Oncomine数据库获取的TRIM66在脑神经胶质瘤组织和正常脑组织中的表达数据使用Mann-Whitney U检验法进行分析。通过Kaplan-Meier曲线描述患者的总生存率,并通过Log-rank检验分析TRIM66表达与患者总生存率之间的关系。细胞功能实验获取的对照组和实验组数据使用Student′s t检验进行分析。P<0.05表示组间存在显著性差异。结果:1.TRIM66在脑神经胶质瘤中的表达及病理意义TRIM66在脑神经胶质瘤组织中高表达,95例脑神经胶质瘤组织中有52例（54.7%）呈阳性表达。TRIM66在胶质瘤细胞系中高表达。TRIM66蛋白表达量与胶质瘤组织分级显著相关（p=0.0284）。TRIM66 mRNA表达水平与胶质瘤患者的总生存时间呈负相关。2.TRIM66促进脑神经胶质瘤细胞增殖,侵袭以及周期进展通过质粒以及si RNA转染技术,双向调控胶质瘤细胞中TRIM66的表达水平。结果显示TRIM66过表达后,细胞的增殖比率升高,形成的集落数目增加,穿越基底胶的数目增加。TRIM66过表达后,处于S期的细胞所占比例升高,处于G1期的细胞所占比例降低。提示TRIM66过表达促进胶质瘤细胞增殖,侵袭以及周期转化。而TRIM66表达缺失后,表现出相反的生物学作用,细胞的增殖侵袭以及细胞周期转化受到抑制。3.TRIM66增强脑神经胶质瘤细胞替莫唑胺化疗耐药性TRIM66过表达和表达沉默的胶质瘤细胞系,经过替莫唑胺处理,进行凋亡诱导。Annexin V/PI双染实验结果表明TRIM66过表达后,胶质瘤细胞的凋亡比率降低,TRIM66表达沉默后细胞凋亡比率上升。JC-1染色实验结果表明TRIM66过表达绿色荧光强度降低,TRIM66表达沉默后绿色荧光强度升高,提示TRIM66在维持正常线粒体膜电位方面发挥关键作用。4.TRIM66促进脑神经胶质瘤细胞的葡萄糖代谢肿瘤细胞通过葡萄糖代谢产生大量ATP,是维持肿瘤细胞增殖和耐药所必需的。胶质瘤细胞系中,TRIM66过表达后,细胞的葡萄糖代谢增强,葡萄糖摄取量及消耗量增加,ATP生成量上升。相反,TRIM66表达缺失后,细胞中葡萄糖代谢减弱,葡萄糖摄取量及消耗量降低,ATP生成量减少。5.TRIM66促进转录因子MYC及其靶基因GLUT3（SLC2A3）的表达TRIM66过表达上调胶质瘤细胞系中葡萄糖代谢相关转录因子MYC及其靶基因GLUT3的表达量,TRIM66表达缺失则下调MYC及GLUT3的表达量。通过小RNA干扰技术,沉默胶质瘤细胞中MYC中的表达,可逆转TRIM66对GLUT3的上调效应。Ch IP结果显示胶质瘤细胞系中,转录因子MYC可与GLUT3启动子区直接结合。结论:TRIM66在脑神经胶质瘤组织和细胞系中表达增加。TRIM66高表达水平与脑神经胶质瘤的分级显著相关,与患者的总生存时间呈负相关。TRIM66促进脑神经胶质瘤细胞增殖,侵袭,周期进展,并增强替莫唑胺化疗耐药性。TRIM66通过激活葡萄糖代谢相关转录因子MYC,上调其靶基因GLUT3的表达水平,促进脑神经胶质瘤细胞的葡萄糖代谢,为维持肿瘤细胞的生长提供所需ATP。