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豆酱是中国传统的发酵食品，传承至今已有近3000年的历史。中国各地都有制作豆酱的风俗，尤其在东北，豆酱几乎成为每家每户必备的佐餐美食。“整体制曲法”是东北地区豆酱的主要制作方法。从农历新年到第二年的5月，豆酱暴露于空气中任由空气中的微生物自然发酵，并形成了豆酱表面丰富的微生物类群。豆酱中有很多种类的真菌，它们产生各种水解酶分解大豆的营养变为易被人体吸收利用的小分子物质。在以往的研究中，关于东北地区发酵豆酱中存在哪些真菌类群，有哪些优势菌株参与到了豆酱的发酵过程，目前还没有详尽的报道。鉴于豆酱在东北地区饮食生活中的重要地位，本研究从2013年至2017年间，采集东三省范围内26个城市72个地区近300余户的农民家庭，采集自制豆酱样品388份。采用传统的分离培养和现代高通量测序相结合的方法全面地分析东北地区自然发酵豆酱中的真菌类群，筛选优质发酵功能菌株。本论文围绕以上目的展开，得到如下研究内容及结果:
(1)采用传统的分离培养共获得25属真菌，采用高通量测序共检测出76属真菌。本研究采用稀释分离和直接分离两种方法，选用孟加拉红培养基作为主要分离培养基，经形态学和分子生物学鉴定，从东北三省的自制豆酱样品中分离获得25属82种真菌。其中接合菌3属14种，子囊菌4属7种，无性型真菌18属61种;青霉Penicillium的分离频率为39.2％，是存在于发酵豆酱中数量最多的真菌类群。采用高通量测序共检测到76属真菌，其中子囊菌57属，为豆酱中数量最多的真菌类群。Ophiocordyceps(14.78％)、Debaryomyces(17.37％)、Dipodascus(3.22％)、Wickerhamomyces(1.89％)、Penicillium(2.26％)、Epicoccum(1.39％)、Fusarium(1.15％)和一些没有确定到属的类群Capnodiales(2.01％)、Trichocomaceae(37.4％)、Tremellomycetes(2.72％)、Nectriaceae(1.14％)、Mucoraceae(1.6％)、Saccharomycetes(1.05％)、Saccharomycetales(8.78％)的片段数量共占真菌总序列的96.76％，分布于各地的样品中。发菌科真菌Trichocomaceae、德巴利酵母Debaryomyces和青霉Penicillium在各地样品中都有分布，但数量上存在着很大的差异。对以家庭为单位自制的发酵豆酱来讲，制作工艺、制作环境的差异以及生产过程中人为干扰等因素都会引起豆酱中真菌类群的变化。正因为有很多外部因素的影响，使得每一份豆酱样品都有自己独特的真菌组成。
(2)经蛋白酶活性初筛获得116株产蛋白酶菌株，去掉酶活较低的种类，有33株表现出相对较高的蛋白酶活性。其中米曲霉Aspergillus oryzae HGPA20和光孢青霉Penicillium glabrum GQ1-3的酶活最高，分别为121.96±1.27和127.193±1.595μg/mL·min。研究通过可溶性淀粉平板初筛和麦麸固体培养基复筛，共得到29株产淀粉酶的菌株。通过三丁酸甘油酯平板初筛和大豆固体培养基复筛，共得到21株产脂肪酶的菌株。在获得的这些产酶菌株中，青霉和曲霉无论数量还是种类都占有绝对的优势，是豆酱发酵过程中重要的功能菌株。此外，毛霉、镰孢、帚霉、芽枝也能产生蛋白酶和淀粉酶，有两株毛霉也检测到了脂肪酶活性。
(3)将米曲霉HGPA20和光孢青霉GQ1-3接种豆酱进行单菌发酵，40天时GQ1-3和HGPA20的发酵豆酱中氨基酸态氮含量均达到最大值，分别为0.59±0.023g/100mL和0.56±0.008g/100mL。研究通过国标的方法检测发酵豆酱的水分、pH、总酸、氨基酸态氮、还原糖、脂肪等指标，发现豆酱中的氨基酸态氮、还原糖和总酸含量都随着发酵时间的推移而稳步增加，各检测组分达到最大值的时间不同，主要集中在40-60天。粗脂肪的含量在发酵的前70天都呈现出明显的下降趋势。
(4)本研究通过GC-TOFMS分析，从两株菌的发酵豆酱中检测出350种代谢物。通过单变量、多变量和KEGG分析得到72种差异代谢产物，筛选出7条与发酵密切相关的差异代谢途径，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与差异代谢物和发酵过程的相关性最高。氨基酸生物合成和TCA循环是两株菌发酵过程中重要的生命活动。参与这个过程的代谢物，如α-酮戊二酸、异亮氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸等，在菌株GQ1-3发酵豆酱中的相对含量高于HGPA20，而延胡索酸、L-苹果酸、琥珀酸、L-高丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等在菌株HGPA20发酵豆酱中相对含量较高。研究结果揭示了两种菌的发酵体系中呈鲜物质存在着明显的差异。
本论文明确了东北地区自制豆酱中的真菌多样性，丰富了发酵食品中功能真菌的种类，并为提高发酵豆酱的品质奠定了理论基础和菌种资源。
(1)采用传统的分离培养共获得25属真菌，采用高通量测序共检测出76属真菌。本研究采用稀释分离和直接分离两种方法，选用孟加拉红培养基作为主要分离培养基，经形态学和分子生物学鉴定，从东北三省的自制豆酱样品中分离获得25属82种真菌。其中接合菌3属14种，子囊菌4属7种，无性型真菌18属61种;青霉Penicillium的分离频率为39.2％，是存在于发酵豆酱中数量最多的真菌类群。采用高通量测序共检测到76属真菌，其中子囊菌57属，为豆酱中数量最多的真菌类群。Ophiocordyceps(14.78％)、Debaryomyces(17.37％)、Dipodascus(3.22％)、Wickerhamomyces(1.89％)、Penicillium(2.26％)、Epicoccum(1.39％)、Fusarium(1.15％)和一些没有确定到属的类群Capnodiales(2.01％)、Trichocomaceae(37.4％)、Tremellomycetes(2.72％)、Nectriaceae(1.14％)、Mucoraceae(1.6％)、Saccharomycetes(1.05％)、Saccharomycetales(8.78％)的片段数量共占真菌总序列的96.76％，分布于各地的样品中。发菌科真菌Trichocomaceae、德巴利酵母Debaryomyces和青霉Penicillium在各地样品中都有分布，但数量上存在着很大的差异。对以家庭为单位自制的发酵豆酱来讲，制作工艺、制作环境的差异以及生产过程中人为干扰等因素都会引起豆酱中真菌类群的变化。正因为有很多外部因素的影响，使得每一份豆酱样品都有自己独特的真菌组成。
(2)经蛋白酶活性初筛获得116株产蛋白酶菌株，去掉酶活较低的种类，有33株表现出相对较高的蛋白酶活性。其中米曲霉Aspergillus oryzae HGPA20和光孢青霉Penicillium glabrum GQ1-3的酶活最高，分别为121.96±1.27和127.193±1.595μg/mL·min。研究通过可溶性淀粉平板初筛和麦麸固体培养基复筛，共得到29株产淀粉酶的菌株。通过三丁酸甘油酯平板初筛和大豆固体培养基复筛，共得到21株产脂肪酶的菌株。在获得的这些产酶菌株中，青霉和曲霉无论数量还是种类都占有绝对的优势，是豆酱发酵过程中重要的功能菌株。此外，毛霉、镰孢、帚霉、芽枝也能产生蛋白酶和淀粉酶，有两株毛霉也检测到了脂肪酶活性。
(3)将米曲霉HGPA20和光孢青霉GQ1-3接种豆酱进行单菌发酵，40天时GQ1-3和HGPA20的发酵豆酱中氨基酸态氮含量均达到最大值，分别为0.59±0.023g/100mL和0.56±0.008g/100mL。研究通过国标的方法检测发酵豆酱的水分、pH、总酸、氨基酸态氮、还原糖、脂肪等指标，发现豆酱中的氨基酸态氮、还原糖和总酸含量都随着发酵时间的推移而稳步增加，各检测组分达到最大值的时间不同，主要集中在40-60天。粗脂肪的含量在发酵的前70天都呈现出明显的下降趋势。
(4)本研究通过GC-TOFMS分析，从两株菌的发酵豆酱中检测出350种代谢物。通过单变量、多变量和KEGG分析得到72种差异代谢产物，筛选出7条与发酵密切相关的差异代谢途径，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与差异代谢物和发酵过程的相关性最高。氨基酸生物合成和TCA循环是两株菌发酵过程中重要的生命活动。参与这个过程的代谢物，如α-酮戊二酸、异亮氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸等，在菌株GQ1-3发酵豆酱中的相对含量高于HGPA20，而延胡索酸、L-苹果酸、琥珀酸、L-高丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等在菌株HGPA20发酵豆酱中相对含量较高。研究结果揭示了两种菌的发酵体系中呈鲜物质存在着明显的差异。
本论文明确了东北地区自制豆酱中的真菌多样性，丰富了发酵食品中功能真菌的种类，并为提高发酵豆酱的品质奠定了理论基础和菌种资源。