随着电离辐射在医学和工业中应用的增加,低剂量辐射(LDR)也引起人们的高度重视,但有关LDR长期暴露的效应和机制尚不明确。LDR效应与高剂量辐射(HDR)效应不同,主要包括辐射超敏反应、基因不稳定性、辐射适应性反应和旁效应等。除电离辐射外,环境中还存在许多化学污染物也危害着人类的健康。由于重金属镉(Cd)在工业上的广泛应用,其对人类健康的影响也受到广泛关注。大量研究证实大剂量Cd和电离辐射均是重要的致癌因子,但有关长期低剂量Cd和长期LDR生物效应的研究较少,而有关二者联合效应的研究更少。众所周知,DNA甲基化是表观遗传学研究最广泛的机制之一,其在多种基础生命活动中均发挥重要调节作用。大量研究显示,啮齿类动物和人类细胞株在暴露于电离辐射后其DNA甲基化模式均会发生改变,同时,也有研究证实LDR相关效应和风险本质上可能与表观遗传学方面的调控有关,尤其是DNA甲基化方面的调控,但机制尚不明确。另外,有研究证实全基因组高甲基化以及特异性基因高甲基化在Cd诱导多种细胞恶性转化过程中也发挥重要作用。本研究采用长期低剂量γ射线及长期低剂量Cd对人B淋巴母细胞(HMy2.CIR)进行处理,研究二者对HMy2.CIR细胞的生物效应及DNA甲基化在其中的作用。同时,对LDR和Cd的交叉适应性反应(cross-AR)及相关机制进行了研究。更深层次地理解长期LDR及长期低剂量Cd效应的分子机制将有助于我们更好地对环境物理化学毒素对人体健康的影响进行评估,也为人们正确防护环境理化毒素提供有力的实验依据。本研究内容分为以下三个部分：第一部分：长期低剂量Y射线对淋巴母细胞的生物学效应及DNA甲基化在其中的作用目的：探讨长期低剂量γ射线对人B淋巴母细胞(HMy2.CIR)增殖、辐射敏感性以及适应性方面的影响,并简要探讨DNA甲基化在其中的作用。方法：选用可以显著促进细胞增殖的低剂量γ射线对HMy2.CIR细胞进行照射,每周一、三、五照射,每次0.032Gy,连续照射4周(4w),并设非照射对照组。以微核形成实验检测细胞DNA损伤,以CCK-8法检测细胞增殖,以胞嘧啶延伸实验检测细胞全基因组甲基化情况,用流式细胞术检测细胞凋亡和γ-H2AX蛋白的表达,以real-time RT-PCR法检测基因cyclinD1、PCNA、bcl-2和bax的表达,以Western blotting法检测蛋白HP1和MeCP2的表达。结果：长期LDR可以显著提高HMy2.CIR细胞的增殖率并诱导周期相关基因cyclinD1和增殖细胞核抗原PCNA表达增加。同时,长期LDR可以诱导淋巴母细胞对攻击剂量(2Gy)电离辐射产生适应性反应,与单纯2Gy照射组相比,LDR+2Gy组细胞的凋亡率、微核形成率及γ-H2AX蛋白表达量均显著降低。Real-time RT-PCR检测发现长期LDR处理细胞抗凋亡基因bcl-2表达升高而抑凋亡基因bax表达降低。胞嘧啶掺入实验检测发现长期LDR处理后全基因组DNA发生高甲基化,这种高甲基化伴随甲基转移酶1(DNMT1)、甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)以及异染色质蛋白1(HP1)表达的升高。另外,用DNA甲基转移酶抑制剂(5-aza-dC)处理细胞后发现长期LDR诱导的细胞辐射适应性反应(RAR)消失。结论：长期LDR处理可通过改变基因表达而促进细胞增殖,同时也可以通过改变细胞全基因组甲基化状态及诱导凋亡抵抗进而终诱导细胞产生RAR。第二部分：低剂量镉长期暴露对淋巴母细胞增殖的影响及其分子途径目的：本部分着重研究低剂量Cd长期暴露对人B淋巴母细胞(HMy2.CIR)增殖的影响,并探讨周期抑制基因p16基因及DNA甲基化在其中的作用。方法：以0、0.005、0.01、0.1μM浓度的氯化镉(CdCl2)处理HMy2.CIR细胞,实验分为两组：短期处理组和长期处理组,短期组Cd处理48h,长期组Cd处理3个月(3m)。采用细胞计数法检测HMy2.CIR细胞增殖情况；以real-time RT-PCR法检测DNMT1、DNMT3b和p16等基因表达；用胞嘧啶延伸实验检测细胞全基因组甲基化状态；用微核形成实验检测细胞损伤；用甲基化特异性PCR(MSP)法检测p16基因启动子的甲基化状态。结果：低剂量Cd短期暴露可以明显促进HMy2.CIR细胞增殖,而低剂量Cd长期暴露促进细胞增殖的作用更加显著。Real-time RT-PCR检测长期低剂量Cd暴露细胞发现DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3b表达升高,而周期抑制基因p16表达下降。长期低剂量Cd暴露后全基因组发生高甲基化,且p16基因启动子也发生高甲基化改变。此外,用5-aza-dC处理低剂量Cd长期暴露细胞可以显著降低细胞增殖并恢复p16基因的表达。结论：低剂量Cd长期暴露通过诱导周期抑制基因p16启动子高甲基化而抑制该基因的表达,并诱导HMy2.CIR细胞增殖加快,这可能是Cd致细胞恶性转化的分子机制之一。第三部分长期低剂量γ射线与低剂量镉诱导细胞交叉适应性反应及机制目的：本研究主要探讨长期(4w) LDR与长期(3m)低剂量Cd诱导人B淋巴母细胞(HMy2.CIR)交叉适应性反应(cross-AR),并探讨DNA甲基化在其中的作用。方法：长期LDR组细胞每周一、三、五照射,每次0.032Gy,连续照射4w,并设非照射对照组。长期低剂量Cd处理以0、0.005、0.01、0.1μM浓度的CdCl2连续处理细胞3m。在各组细胞受攻击剂量CdCl2和γ射线处理后用微核形成实验检测细胞适应性反应(AR)及cross-AR。结果：长期低剂量Cd能诱导HMy2.CIR细胞对随后高剂量Cd及丫射线产生适应性反应及交叉适应性反应。当攻击剂量为50μM CdCl2时,细胞表现出显著的适应性反应,但当剂量增加到100μM CdCl2时并未诱导细胞产生显著的适应性反应。同时,我们发现不同浓度的低剂量Cd长期暴露所诱导的适应性反应程度(MAR)不同,并具有一定的剂量-效应关系。当攻击剂量为2Gy γ射线时细胞产生的MAR最显著。长期LDR处理同样诱导HMy2.CIR细胞对随后高剂量Cd及γ射线产生AR及cross-AR。当攻击剂量为50μM CdCl2时,长期LDR处理诱导细胞的MAR最为显著,当攻击剂量为2Gyγ射线时细胞产生的MAR低于攻击剂量为50μM CdCl2时的MAR,但当攻击剂量为100μM CdCl2时,并未诱导细胞产生显著的适应性反应。此外,用DNA甲基转移酶5-aza-dC处理各组细胞后发现长期低剂量Cd及长期LDR诱导细胞的适应性反应均消失。结论：长期低剂量Cd及长期LDR均能够诱导HMy2.CIR细胞对随后高剂量Cd及丫射线产生适应性反应。细胞产生MAR的大小与预处理剂量和攻击处理剂量的大小密切相关。另外,DNA甲基化在二者诱导的交叉适应性反应中也发挥重要作用。