【摘 要】
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背景:靶点的确认与发现对明确药物的作用机制及药物修饰改造具有重要作用。课题组前期合成的系列大黄酸衍生物对多种肿瘤细胞增殖和转移有明显的抑制作用,而近期合成的含氮甲酰胺蒽醌修饰物是否调控Rac1活性及其靶点蛋白尚未明确。目的:以Rac1蛋白为靶点,利用分子对接软件评价设计合成系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物与Rac1的结合能力,通过含Rac1启动子的萤光素酶报告基因系统确认含氮甲酰胺蒽醌修饰物调控Rac1活
【基金项目】
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大黄素杂合物4m触发非凋亡程序性死亡抑制卵巢癌浸润转移的新机制,项目合同编号:2018GXNSFAA281064,项目来源:广西自然科学基金项目,项目起止时间:2018年11月-2022年11月； 基于Rac1与EGFR双靶点的新化合物H对三阴性乳腺癌浸润转移的作用研究,项目合同编号:YCSW2019107,项目来源:广西研究生创新计划,项目起止时间:2019年3
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背景:靶点的确认与发现对明确药物的作用机制及药物修饰改造具有重要作用。课题组前期合成的系列大黄酸衍生物对多种肿瘤细胞增殖和转移有明显的抑制作用,而近期合成的含氮甲酰胺蒽醌修饰物是否调控Rac1活性及其靶点蛋白尚未明确。目的:以Rac1蛋白为靶点,利用分子对接软件评价设计合成系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物与Rac1的结合能力,通过含Rac1启动子的萤光素酶报告基因系统确认含氮甲酰胺蒽醌修饰物调控Rac1活性、建立药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）实验技术,结合质谱分析确定含氮甲酰胺蒽醌修饰物的蛋白靶点。方法:1.采用分子对接软件评估大黄酸及系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物与Rac1蛋白的相互作用结合能力;利用MTT法检测新合成的含氮甲酰胺蒽醌化合物对于多种肿瘤细胞的抗肿瘤活性;含Rac1启动子萤光素酶报告基因系统检测在细胞转录水平比较大黄酸及含氮甲酰胺蒽醌修饰物对Rac1表达的调控作用,Western Blot实验在蛋白水平验证及含氮甲酰胺蒽醌修饰物对Rac1蛋白的调控,初步确定含氮甲酰胺蒽醌修饰物调控Rac1活性。2.提取高表达Rac1的三阴性乳腺癌MDA-MB-231总蛋白,加入Rac1抑制剂NSC23766,选择链酶蛋白酶作为水解酶,采用正交实验确定水解蛋白酶作用浓度、作用时间、作用温度,探索DARTS方法最佳条件。分别以先导化合物Rhein及系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物以IC50的1倍、5倍、10倍浓度进行DARTS实验,寻找差异蛋白条带,同时使用Western Blot实验检测Rac1蛋白分子表达,采用LC-MS/MS质谱鉴定差异蛋白条带,使用Proteome Discoverer 1.3进行检索差异蛋白信息,最终确定含氮甲酰胺蒽醌修饰物蛋白靶点。结果:1.分子对接结果表明,系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物4H、4L、4C、4D、4E与Rac1蛋白分子的结合能接近或低于Rac1抑制剂NSC23766与Rac1蛋白分子结合能,其中,Rac1抑制剂NSC23766与Rac1的结合能为-14.6767k J/mol,4D与Rac1的结合能为-20.7953 k J/mol,4E与Rac1的结合能为-17.5990 k J/mol,改构之后的修饰物4D、4E靶向调控Rac1的能力更强。MTT检测结果显示,系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物对多种肿瘤细胞均具有良好的抗肿瘤活性,结果显示所有修饰物的IC50均低于12μM,其抑制活性均明显优于先导化合物大黄酸（P＜0.01）。使用萤光素酶报告系统检测系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物的萤光素酶表达变化,修饰物4C、4D和4E的萤光素酶表达倍数低于NSC23766的萤光素酶表达倍数,初步认定修饰物4C、4D、4E调控Rac1蛋白的能力较强。2.通过正交实验发现,当酶质量与蛋白质质量比为1:1000,酶解作用时间为20min,酶解作用温度为37℃时为DARTS实验最佳条件。使用该条件对不同浓度NSC23766进行条件验证,Rac1蛋白表达随着浓度增加条带变深,证明NSC23766与Rac1蛋白进行有效结合。使用该条件对先导化合物及系列含氮甲酰胺蒽醌修饰物进行酶解实验,同时采用Western blot检测Rac1表达变化,发现修饰物4C、4D、4E作用于MDA-MB-231细胞总蛋白后,Rac1蛋白分子结合条带随浓度升高而变深,与萤光素酶实验结果相一致。将差异条带进行剪裁后,制样及进行质谱鉴定后,进行生物信息与结构分析,初步确定含氮甲酰胺蒽醌修饰物4C、4D的蛋白靶点可能为CFL1蛋白,其靶点通路可能涉及CFL1/Rac1通路。结论:1.依据MOE分子对接软件合成的含氮甲酰胺蒽醌修饰物对于多种肿瘤细胞具有良好的抑制活性,IC50均优于先导化合物大黄酸,大部分修饰物可抑制Rac1蛋白活性。3.DARTS技术联合质谱分析,确定含氮甲酰胺蒽醌修饰物4C、4D的靶蛋白为CFL1,其靶向通路与CFL1/Rac1有关,且所建立的DARTS方法具有操作简便、耗时短等优点,可应用于药物小分子靶蛋白的寻找。
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