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背景肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是临床上比较常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率一直居高不下,对人类健康是一个巨大威胁。如何有效预防和治疗HCC显得非常重要。指导教师前期工作证实了一种广谱抗菌老药-硝呋齐特（Nifuroxazide）具有一定的抗HCC作用。然而,影响肿瘤进展的因素很多,单一药物的疗效也受到了很大制约,为此,越来越多的联合方案被用在了临床肿瘤治疗中。尤其随着免疫学研究的不断深入,化学药物与免疫疗法联合治疗肿瘤成为了一种趋势。研究显示,程序性死亡受体-配体1（Programmed Cell Death-Ligand 1,PD-L1）高表达于HCC细胞表面,能够与T细胞表面的PD-1结合抑制T细胞的抗肿瘤作用。阻断PD-1/PD-L1通路能够发挥一定的抗肿瘤作用。指导教师前期构建了一种siRNA-PD-L1序列,能够明显抑制肿瘤细胞中PD-L1的表达。目的探索了应用减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1序列联合Nifuroxazide对HCC荷瘤小鼠的治疗作用,并从免疫学角度初步探索了其作用机制。方法1.肝细胞癌荷瘤小鼠模型的建立所有动物实验均按照《实验动物管理条例》以及新乡医学院伦理委员会的要求进行。将冻存的小鼠肝细胞癌H22细胞复苏后,使用台盼蓝染色计数活细胞数量,计数后将细胞浓度调整为1.5×107细胞/ml,将准备好的细胞放置于冰上,使用C57BL/6小鼠进行模型的建立。具体为:小鼠右后背部,使用注射器皮下注射细胞悬液100μl,细胞数为1.5×106细胞。2.减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1联合硝呋奇特抗HCC荷瘤小鼠作用研究模型建立后7天,随机将模型小鼠分为以下5组:PBS组、Scramble组、Nifuroxazide组、siRNA-PD-L1组和Nifuroxazide联合siRNA-PD-L1组,每组6只老鼠。分组之后,按照以下方式进行治疗:PBS组小鼠接受100μl PBS,Scramble组小鼠接受100μl（5×105 cfu）携带scramble质粒的减毒沙门菌,Nifuroxazide组按照200μg/只小鼠注射Nifuroxazide,siRNA-PD-L1组小鼠接受100μl（5×105 cfu）携带siRNA-PD-L1质粒减毒沙门氏菌的治疗,联合治疗组分别按照以上方法给予Nifuroxazide和携带siRNA-PD-L1质粒减毒沙门氏菌的治疗。其中Nifuroxazide每天治疗一次,共7次;减毒沙门氏菌每周给予1次治疗,共两次。治疗结束后第7天,将每组小鼠脱臼处死,分离肿瘤组织,进行检测。（1）将分离的小鼠肿瘤分别拍照并称重,检测减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1联合Nifuroxazide对小鼠肿瘤生长的抑制作用。（2）通过蛋白印迹方法检测肿瘤中PD-L1、Cyclin D1等蛋白表达;通过Tunel实验检测肿瘤组织中的细胞凋亡;通过免疫组化检测肿瘤中Ki-67蛋白的表达;通过免疫荧光检测肿瘤中T淋巴细胞及M1型巨噬细胞浸润;通过流式细胞术检测小鼠脾脏中T淋巴细胞及NK细胞比例。结果1.通过检测荷瘤小鼠的肿瘤重量发现,PBS组小鼠的肿瘤重量为3.2±0.78g,Scramble组小鼠的肿瘤重量为2.95±0.36g,Nifuroxazide或siRNA-PD-L1组小鼠的肿瘤重量分别为1.09±0.03g,1.15±0.25g相比,其肿瘤重量与对照相比P＜0.05,二者联合肿瘤重量为0.63±0.3g,与单一治疗组相比P＜0.05;2.通过Tunel凋亡实验检测发现,与PBS及Scramble组相比,Nifuroxazide或siRNA-PD-L1组小鼠肿瘤组织中的细胞凋亡明显,二者联合增加的更加明显。通过免疫组化检测增殖相关蛋白Ki-67的结果显示出了同样的趋势;3.通过Western blot实验检测发现,与PBS及Scramble组相比,Nifuroxazide或siRNA-PD-L1治疗明显抑制了肿瘤组织中PD-L1、Cyclin D1的表达以及p-Stat3的磷酸化,增加了凋亡相关蛋白Cleaved-PARP的表达,当二者联合时这一趋势更加明显;4.通过免疫荧光检测发现,Nifuroxazide或siRNA-PD-L1治疗显著提高了小鼠肿瘤组织中T淋巴细胞以及M1型巨噬细胞的浸润,二者联合治疗组肿瘤组织中细胞浸润的数量最多;5.通过流式细胞术检测发现,Nifuroxazide与siRNA-PD-L1治疗显著增加了小鼠脾脏中T淋巴细胞及NK细胞中的比率,与任一组相比,联合治疗组的比率都是最高的,P＜0.05。结论减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1联合硝呋奇特能够有效地发挥协同抗小鼠HCC作用,增加了肿瘤细胞的凋亡,抑制了其增殖,提升了荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫。该论文为应用细菌作为siRNA-PD-L1运载体,同时联合Nifuroxazide来治疗HCC提供了一定的实验依据。