单环刺螠血红蛋白F-I全长cDNA序列克隆、原核表达及抗菌活性研究

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血红蛋白(Hemoglobin,Hb)是一种具有运载氧、阿片肽、免疫调节、抗菌和镇痛等功能的蛋白。本课题研究表明Hb片段(hemocidins)是机体在先天性免疫中杀死外源微生物的重要因子。单环刺螠(Urechis unicinctus,Uu)隶属于螠虫动物门,是具有重要经济价值的无脊椎动物。其长期生活在海边潮间带泥性底质中,为滤食性动物,直接暴露于各种病原菌及寄生虫等,但其非特异性免疫系统成功地抵御外来入侵,其中Hb可能起重要作用,而目前对Uu Hb的研究没有相关报道。本课题根据Uu同属物种美洲刺螠(Urechis caupo,Uc)Hb F-I完整的cDNA序列(GI:945055),通过3’RACE和5’RACE克隆了Uu Hb F-I的全长cDNA,共780bp。开放阅读框含429bp,翻译为含142个氨基酸残基的成熟肽,命名为UuHb-F-I。预测分子量为15120.67Da,等电点为9.02,其二级结构中含大量α螺旋。为获得UuHb-F-I,构建原核表达系统BL21(DE3)/pET-22b-UuHb-F-I,经IPTG和乳糖诱导表达成功,其中乳糖诱导在37℃、180r/min诱导16h时,重组蛋白可达最大表达量,且杂蛋白较少。大量诱导表达后,尿素溶解包涵体,使用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,洗脱的目的蛋白含杂蛋白少。通过多次透析逐渐除去尿素及其它盐离子,最后冷冻干燥得重组蛋白固体。采用液相分析法(liquid phase assay)对重组蛋白进行抗菌活性试验,选用革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌共8种微生物,研究发现UuHb-F-I对某些革兰阳性菌的抗菌活性强于革兰阴性菌,其中对藤黄微球菌的MIC最小,可达2.78~4.63μM。研究结果可能有助于了解无脊椎动物(单环刺螠)的免疫防御机制,同时为新型抗菌肽在药物研发上提供新的启发。
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