血管钙化是羟基磷灰石结晶、无定形钙等在多种细胞的介导下主动沉积在血管系统的复杂病理改变,可导致血管壁僵硬、血管狭窄度升高及顺应性下降等。糖尿病是血管钙化的高危因素之一;相比非糖尿病患者,糖尿病患者的血管钙化好发部位不同,起病更为隐匿,呈多发性且更为严重,显著增加了心血管事件及截肢等不良预后的发生。而晚期钙化的治疗手段有限:多数上市治疗药物如焦磷酸盐等已被发现有严重副反应而使用受限;介入旋磨及激光消蚀等手术治疗可造成冠脉穿孔及下游小血管的栓塞。鉴于以上血管钙化的临床意义及晚期治疗的瓶颈,我们迫切的需要为糖尿病性血管钙化建立更为合理的早期诊断体系,以便对其采取及时的临床干预。目前临床上现有的针对血管钙化的检测以影像学检测手段为主,包括平扫CT、X线摄影、普通超声及血管内超声(intravenous ultrasound,IVUS)等。平扫CT准确度较高,但仅应用于冠状动脉钙化的评估,未在外周大血管钙化的检测广泛使用;IVUS是钙化检测的金标准,但其为侵袭性检测,不适合人群普查;普通超声及X线片对血管钙化检查的部位有限,B超目前仅适用于浅表血管钙化的探测,对深部血管无能为力;使用X线片的钙化积分因其他部位缺乏类似脊椎骨的天然分段标志,仅应用于腹主动脉钙化的计算。以上检查种种原因的限制,导致了血管钙化的检出率低,且相关诊断标准尚未覆盖所有糖尿病血管钙化的多发部位,如膝以下的下肢动脉;另外,也无法对患者进行全身性血管钙化检测和全方位的评估,这是目前血管钙化检测的瓶颈。因此,我们期望能够开发新的钙化评估方法或生物学靶标,为糖尿病血管钙化提供早期预防、早期诊断及早期治疗的新思路。在本研究中,我们从影像学及血清免疫学两个方面对糖尿病患者的血管钙化评估方法进行了探讨。影像学方面,我们提出了一种基于螺旋CT的下肢血管钙化评价指数(LCI)并在临床和病理学实验中证实了其准确性和有效性;血清免疫学方面,我们通过临床实验对一种或可用于糖尿病全身性初期血管钙化免疫诊断的血清成分,即Nε-羧甲基赖氨酸水平(Nε-carboxymethyl lysine,CML)的有效性进行了确认,并对其具体作用机制进行了深入研究。各部分内容概括如下:第一部分:基于多层螺旋CT新钙化指数的构建及其在糖尿病足患者下肢动脉钙化中的作用评价目的:因现有的糖尿病下肢动脉钙化程度的评估方法存在一定缺陷,本研究期望构建一种新下肢动脉钙化指数(lower limb arterial calcification index,LCI),并观察其在下肢动脉钙化评估中的应用。方法:选取2016.1-2019.1在江苏大学附属医院住院治疗的糖尿病足(diabetic foot,DF)患者254例,依据Wagner诊断标准分为6组。尝试构建下肢动脉新钙化指数,参考Bollinger的血管分段方法,将膝以下的下肢血管(胫前动脉/胫后动脉/腓动脉)分成六个部分,参考已在临床广泛应用的Kaupplila的腹主动脉钙化指数(abdominal aortic calcification index,ACI)评分标准,为每个血管段进行评分;将所有血管段的得分相加计算LCI总得分。探究了患者DF等级以及随访中截肢事件发生与LCI的相关性;对DF等级5级患者的截肢部位血管进行病理学钙含量检测,探究LCI与血管钙含量的一致性。针对钙化指数对斑块内部钙化考虑不足的问题,研究血管狭窄度(vascular stenosis,VS)对钙含量及LCI之间的调节作用,以对LCI进行必要的补充。结果:我们成功构建了下肢动脉钙化指数的评价体系,其能够对糖尿病足患者下肢动脉钙化进行有效定量评估,并可以在一定程度上预测糖尿病足患者截肢的风险。在LCI有效性的验证上,临床试验结果表明,LCI得分随DF等级显著提高;终点事件为下肢或足部截肢的2年随访结果中,被截肢患者的平均LCI分数远高于其他患者;在钙含量病理实验中,截肢患者提供的下肢动脉中LCI和钙含量之间具有显著一致性(W=0.373,P<0.05)。VS是钙含量和LCI的有效调节因素,0.907为临界点。结论:LCI是评估下肢动脉钙化程度有效且易于操作的方法,具备一定程度的截肢风险预测作用。第二部分:糖尿病患者血清Nε-羧甲基赖氨酸水平与颈动脉钙化关系的临床研究目的:已有的钙化评估方法多为针对特定部位的影像学检查,但尚没有对早期全身钙化的评估方法。本研究以早期血管钙化的血清免疫学检查为目标,使用已在课题组前期研究中被证实具有强烈钙化促进作用的糖毒性代谢产物血清CML为标志物,暂选择糖尿病人群中发病率高且发病时间早可以较为准确反应DM患者钙化情况的颈动脉钙化,探究CML与1型和2型DM人群中不同程度钙化的相关性。方法:选取2016.1-2017.6在江苏大学附属医院就诊患者506例,其中1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)148例,2型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T2DM)191例,普通体检健康人167例,所有患者均行彩色多普勒超声检测双侧颈动脉,对颈动脉钙化测量水平进行分级,按照0~8分范围的标准评测,其中0~4分为低钙化组,5~8分为高钙化组。记录患者一般临床资料、体格检查结果、实验室检查结果,并通过酶联免疫吸附实验测量血清CML水平。进行多因素logistic回归分析,以确定1型和2型糖尿病患者不同程度颈动脉钙化的独立预测因子。随访复测CML并追踪不良事件;分析CML变化与不良事件的关系。结果:在颈动脉高钙化组和低钙化组,DM患者的CML、颈动脉内中膜厚度(intima-media thickness,IMT)和低密度脂蛋白水平均高于对照组(P<0.05),且2型糖尿病组高于1型糖尿病组(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,CML不仅与T1DM患者颈动脉高低钙化程度独立相关(CML,OR 2.025,95%CI1.368-2.996;P<0.05),也是T2DM颈动脉钙化程度的独立预测因子(CML,OR2.485,95%CI 1.481-4.171;P<0.05)。随访提示CML水平高且增长速度快的患者更倾向于发生不良事件。结论:CML是1型和2型糖尿病患者不同程度颈动脉钙化的独立危险因素,能够在一定程度上预测糖尿病性心脑血管事件的发生,可考虑作为糖尿病全身血管钙化标志物进一步研究。第三部分:NFATc1参与CML促血管平滑肌细胞钙化调控的研究目的:活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)是成骨破骨平衡的分子开关,在骨重塑中发挥了关键作用。本研究探寻NFATc1是否参与介导CML促进血管壁平滑肌细胞钙化。方法:取第3-5代的小鼠血管平滑肌细胞分为对照组、OM刺激组、CML组,OM+CML组。实验结束后,通过Von kossa染色及茜素红染色检测各组平滑肌细胞的钙化程度,通过Western Blot检测成骨表型相关蛋白和NFATC1的表达,通过si RNA构建NFATc1敲减细胞系,并使用q RT-PCR及Western Blot对干扰效率进行验证,检测CML刺激下NFATC1对血管壁平滑肌细胞钙化的影响。结果:与对照组相比,用含有CML的钙化培养基处理小鼠血管平滑肌细胞后,钙化程度明显增加。同时Western Blot结果显示,CML组NFATc1的表达水平显著提高。Von kossa染色及茜素红染色结果表明NFATc1 si RNA可显著下调CML诱导的血管壁平滑肌细胞钙化。结论:NFATc1介导了CML调控的小鼠平滑肌血管钙化进程。