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目的:微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MCLR)是由富营养化水体中有毒藻类产生的一类具有肝脏毒性的单环七肽毒素。有研究表明低剂量MCLR慢性染毒可促进细胞增殖,诱导肝细胞发生恶性转化、癌变,然而MCLR诱发细胞恶性转化及癌变的具体机制仍有待阐明。白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种天然存在的多酚类化合物,存在于多种植物体内,研究表明其对癌症的预防和治疗具有特殊的作用。本课题研究长期低剂量MCLR暴露对人肝细胞株WRL68的增殖和恶性转化的影响以及白黎芦醇的干预作用;研究白藜芦醇干预作用下,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)H19在MCLR诱导的细胞恶性转化过程中的表达差异,探讨白藜芦醇影响MCLR恶性转化细胞的增殖能力的分子机制。方法:1.构建MCLR诱导的肝细胞恶性转化模型采用10 nmol/LMCLR连续染毒人肝细胞株WRL68,同时设立同代对照组,用含0.01%DMSO的PBS处理。每3天传代一次,使细胞始终暴露于10 nmol/LMCLR,连续培养至第25代。观察不同转化时期细胞形态学的改变;采用MTT实验检测细胞的增殖能力;采用软琼脂实验检测细胞的克隆形成能力,采用裸鼠成瘤实验检测细胞的成瘤能力;采用流式细胞术检测第25代正常对照组及MCLR染毒组的细胞周期及细胞凋亡。2.观察白藜芦醇对MCLR恶性转化细胞的增殖能力及lncRNAH19表达水平的影响常规培养WRL68细胞,设置正常对照组(CON组)、Res低剂量组(25nM Res 组)、Res 高剂量组(100nMRes 组)、MCLR 染毒组(MCLR组)、Res低剂量干预组(MCLR+25nM Res组)、Res高剂量干预组(MCLR+100nM Res组)。各染毒组的细胞始终暴露于10 nmol/L MCLR,而非染毒各组则给予含0.01%DMSO的PBS进行处理,对于Res干预组,MCLR染毒4小时后,分别加入不同浓度的白藜芦醇(终浓度为25 nmol/L和100 nmol/L)。每3天传代一次,连续培养至第25代。动态观察MCLR暴露及白藜芦醇干预下细胞生长的变化情况:采用MTT实验检测细胞增殖能力;采用软琼脂实验评价细胞锚定非依赖性生长能力。运用qRT-PCR动态监测Res干预对MCLR染毒细胞中的lncRNAH19表达水平的影响。3.构建lncRNAH19稳定高表达细胞株通过Gateway技术构建lncRNAH19过表达及阴性对照的慢病毒表达载体;包装慢病毒,并感染人肝细胞株WRL68,用嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株;利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光情况,以判断转染效果,采用qRT-PCR鉴定转染细胞株。4.观察H19高表达对MCLR致肝细胞恶性增殖的影响及白藜芦醇的干预作用常规培养稳定过表达lncRNAH19的WRL68细胞及对应空载细胞,设置①空载组(NC组)、②空载及MCLR染毒组(NC+MCLR组)、③空载及Res高剂量干预组(NC+MCLR+100nM Res组)、④H19高表达组(H19组)、⑤H19高表达及MCLR染毒组(H19+MCLR组)、⑥H19高表达及Res高剂量干预组(H19+MCLR+100nMRes组)。MCLR暴露方式及白藜芦醇干预方式与前述实验一致。采用MTT实验检测细胞增殖能力的变化情况。结果:1.长期低剂量MCLR暴露诱导人肝细胞株WRL68恶性转化(1)使用倒置光学显微镜观察细胞的形态,发现正常对照组细胞呈单层生长,排列有序,细胞核与细胞浆结构清晰。MCLR染毒组细胞则出现细胞边界不光滑,有褶皱,细胞核与细胞浆分界不清晰,核仁数量明显增多,呈浸润型生长。(2)MTT结果显示,培养至第15代时,与对照组相比,MCLR染毒组细胞的增殖变快;第25代细胞MCLR染毒组细胞的增殖速度显著快于同代对照组(P<0.05)。(3)第25代细胞的细胞周期检测结果显示,与同代对照组相比,MCLR染毒组细胞在GO-G1期的比例降低,在G2-M期的比例增高(P<0.05)。(4)第25代细胞的凋亡检测结果显示,MCLR染毒组细胞的凋亡率低于同代对照组(P<0.05)。(5)软琼脂实验结果显示,培养至第15代时,MCLR染毒组可以在软琼脂上形成细胞集落,而同代对照组未见生成细胞集落;培养至第25代时,与同代对照组和第15代MCLR染毒组相比,第25代MCLR染毒组的细胞集落明显增多且体积增大,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)裸鼠成瘤实验结果显示,头颈部接种第15代对照组和MCLR染毒组细胞的裸鼠均未出现肿瘤;接种第25代对照组细胞的裸鼠未出现肿瘤,而接种第25代MCLR染毒组细胞的裸鼠可以观察到肿瘤。病理切片观察显示,瘤组织细胞排列紊乱,核浆比增大,为分化程度低的肝细胞癌。2.白藜芦醇对MCLR转化细胞的增殖能力及lncRNAH19表达水平的影响(1)MTT实验结果显示,培养至第25代时,与同代正常对照组相比,Res低剂量组细胞增殖速度无明显变化,Res高剂量组细胞增殖速度明显变慢,与MCLR染毒组相比,Res低剂量干预组细胞增殖速度无明显变化,Res高剂量组细胞增殖速度明显变慢,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)软琼脂实验结果显示,培养至第25代时,MCLR染毒组、Res高剂量干预组的克隆形成率均高于同代正常对照组(P<0.05),且Res高剂量干预组的克隆形成率低于MCLR染毒组(P<0.01)。(3)qRT-PCR结果显示,从第10代开始,MCLR染毒组细胞H19的相对表达量较同代正常对照组升高,Res高剂量干预组细胞H19的相对表达量较同代MCLR染毒组降低(P<0.05);MCLR染毒组15、20、25代细胞H19的相对表达量明显高于同代正常对照组(P<0.05),且随着染毒代数的增加,H19的相对表达量逐渐增加(P<0.05);Res高剂量干预组15、20、25代细胞H19的相对表达量明显低于同代MCLR染毒组(P<0.05);Res高剂量组15、20、25代细胞H19的相对表达量明显低于同代正常对照组(P<0.05)。3.LncRNAH19稳定高表达细胞株的构建重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳可见约2346 bp的片断,与预期结果一致;酶切后电泳鉴定阳性的质粒经过测序,测序结果与设计一致。慢病毒感染靶细胞后,经2 μg/ml的嘌呤霉素筛选2周后,几乎所有细胞都有荧光,且lncRNA H19在H19稳定转染细胞中的表达水平明显高于空载组(P<0.05)。4.H19高表达对MCLR致肝细胞恶性增殖的影响及白藜芦醇的干预作用MTT实验结果显示,H19高表达组细胞的增殖速度比空载组细胞快;对NC组及H19高表达组细胞进行MCLR暴露及白藜芦醇干预后,MTT实验结果显示,H19+MCLR组细胞增殖速度快于NC+MCLR组(P<0.05);NC+MCLR+100nM Res组较NC+MCLR组细胞的增殖速度下降,H19+MCLR+100nM Res组较H19+MCLR组的细胞增殖速度下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);H19+MCLR+100nM Res 组比 NC+MCLR+100nM Res组的细胞增殖速度快,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.长期低剂量MCLR染毒能够促使人肝细胞WRL68细胞增殖加速,细胞周期G2-M阻滞、凋亡率下降,导致细胞发生恶性转化。Res可抑制MCLR诱导的细胞增殖和恶性转化。2.MCLR诱导WRL68细胞恶性转化过程中lncRNAH19表达水平逐渐升高,Res干预使lncRNA H19表达下调,过表达lncRNAH19能够逆转Res对MCLR恶性转化细胞增殖的抑制作用,提示Res可能通过下调lncRNA H19表达来抑制MCLR诱导的细胞恶性增殖。