帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是影响运动功能障碍的一种神经退行性疾病。该病的主要病理特点为选择性中脑黑质致密部(substanbtianigrapars compacta,SNpc)多巴胺能神经元的减少以及该区域内路易小体的堆积。PD的病因被认为是通过遗传和微环境的相互联合作用而导致多巴胺能神经元的死亡。其中,微环境因素包括氧化应激、内质网应激、神经炎症,线粒体损伤、钙离子平衡紊乱以及神经元细胞凋亡。近年来,有文献报道多巴胺能神经元的死亡与调控中脑多巴胺能神经元再生相关的基因和信号通路网相关。已有研究显示,PD与大量在中脑参与多巴胺能神经发生发展的转录因子相关。本课题通过在体和离体水平,应用分子生物学方法研究转录因子DEC1在MPTP/MPP+所诱导PD模型中多巴胺能神经元凋亡中的作用,为深入研究PD发病机制并为PD的靶向药物研发提供实验依据。人软骨细胞差异表达蛋白(DEC1)是碱性螺旋环螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)超家族成员中的一员,该转录因子广泛表达于正常组织,如软骨、骨、肾、肺、心、肝、脑等。并且,DEC1可通过外界刺激(如缺氧、生长因子、激素、感染等)参与细胞凋亡、细胞分化、脂质代谢、昼夜节律、缺氧等反应。到目前为止,未有文献报道DEC1与多巴胺能神经的发生或发展有关。但是,有文献表明DEC1分布于中枢神经系统中的不同脑区,该转录因子不仅与神经元细胞的可塑性有关,还与中枢神经系统的神经分化和神经成熟有关。我们前期实验发现DEC 1表达于中脑SNpc及腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA),并且与酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞共表达。本研究根据之前的实验基础,发现在MPTP诱导PD模型小鼠中脑SNpc的DEC1表达较对照组小鼠明显降低。在离体实验中,MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡同时,DEC1表达也明显下降,其结果与上述在体实验结果相符合。为了进一步研究DEC1在MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用,我们通过DEC1高表达质粒和shDECl敲减质粒的转染实验发现:过表达DEC1可部分取消由MPP+诱导的细胞凋亡,敲减DEC1可加重由MPP+诱导的细胞凋亡。同时,过度表达DEC1可取消由MPP+所致cleaved caspase 3/caspase 3增加而不能取消MPP+所致Bax/Bcl-2的增加。该结果提示DEC1减轻MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡主要通过降低caspase 3活性。应用LY294002或LiCl以抑制或激活PI3K/Akt通路,结果发现LY294002可加重而LiCl可取消由MPP+诱导的DEC1降低;过度表达DEC 1可明显增加由MPP+所致的PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路蛋白表达降低,而不影响其他Akt下游靶基因,如p-Bad/Bad,p-FoxO1/FoxO1,该结果提示MPP+所致细胞凋亡是通过下调DEC1的表达并与降低PI3K/Akt通路相关蛋白相关。随后,本研究应用不同年龄(四月龄和六月龄)两种基因型(DEC1+/+、DEC1-/-)小鼠,研究DEC1基因敲除对中脑SNpc多巴胺神经元的影响。实验结果发现,仅有年老(六月龄)小鼠DEC1基因缺失可引起其运动功能障碍,年轻和年老小鼠DEC1基因缺失均不能引起其学习和记忆功能障碍。在解剖学实验中,我们发现仅有年老(六月龄)小鼠DEC1基因缺失可特异性地引起SNpcTH+细胞减少和该区域的细胞凋亡。同时,我们还发现,年老(六月龄)DEC 1基因敲除小鼠中脑cleaved caspase 3/caspase 3及PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路相关蛋白表达较同年龄野生型小鼠表达降低。综合以上实验结果提示,成年DEC1基因缺失小鼠(>6月龄),在行为学和解剖学上具有天然形成PD的倾向。这一结果从整体又应证了 DEC1在维持多巴胺神经元功能发挥了重要作用。本研究首次探讨了转录因子DEC1在中脑SNpc多巴胺能神经元凋亡中的作用及机制,为PD发病机制、以DEC1为靶标的研究以及为PD基因基础的新的动物模型的研究提供了新线索。文章主要分为两部分进行研究阐述:第一部分:转录因子DEC1在MPTP/MPP+诱导多巴胺能神经凋亡中的作用及机制的研究第二部分:转录因子DEC1缺失对中脑黑质致密部多巴胺能神经元的的影响及其机制的研究第一部分:转录因子DEC1在MPTP/MPP+诱导的多巴胺能神经凋亡中的作用及机制的研究目的:研究转录因子DEC1在MPTP/MPP+诱导的细胞凋亡中的作用及机制。方法:本部分分为整体实验和离体实验1.整体实验:给予C57BL/6小鼠连续皮下注射MPTP五天,制备PD亚急性模型。观察对照组和造模组行为学改变,免疫荧光检测小鼠中脑TH和DEC1蛋白表达。Western blot方法检测MPTP造模后小鼠中脑TH、DEC1、DAT、凋亡相关蛋白(cleavedcaspase3,caspase3,Bax,Bcl-2)以及 PI3K/Akt 通路相关蛋白(PI3Kp11Oα、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β、β-catenin)表达。2.离体实验:以MPP+刺激SH-SY5Y细胞作为PD的细胞模型,研究DEC1在MPP+诱导神经毒性中的作用及机制。1)首先观察DEC1在MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中的变化。以及与多巴胺神经元的标志性蛋白(TH、DAT)、凋亡相关蛋白(cleaved caspase 3,caspase 3,Bax,Bcl-2)以及PI3K/Akt通路相关蛋白之间的关系。2)通过质粒转染方法构建高表达和低表达DEC1的SHS-Y5Y细胞,用TUNEL染色检测过表达和敲减DEC1在MPP+诱导细胞凋亡中的影响。3)通过过表达质粒检测DEC1与TH、DAT以及凋亡相关蛋白的关系。4)应用药物(LY294002或LiC1)抑制和激活PI3K/Akt通路,检测DEC1在MPP+诱导凋亡中与该通路相关性。5)通过过表达DEC1检测该转录因子在MPP+诱导SH-SY5Y细胞中对PI3K/Akt通路相关蛋白的影响,以探讨其机制。结果:1.与对照组小鼠比较,MPTP造模小鼠(行为学证实)中脑SNpc和VTA TH和DAT表达降低,同时DEC1表达也明显降低;2.MPTP 造模小鼠中脑凋亡相关蛋白(cleaved capase 3/caspase 3、Bax/1Bcl-2)较生理盐水组小鼠比例显著增高;PI3K/Akt通路相关蛋白(PI3Kp110α、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β和 β-catenin)表达水平较生理盐水组小鼠显著降低;3.离体实验中(SH-SY5Y细胞株),MPP+诱导细胞毒性并且抑制DEC1表达,引起凋亡相关蛋白cleaved capase 3/caspase 3及Bax/Bcl-2比值增高、TH和DAT表达降低,提示MPP+诱导的细胞凋亡可能与其降低DEC1有关;4.过表达DEC1可取消部分由MPP+诱导的细胞凋亡作用,敲减DEC1促进MPP+诱导的细胞凋亡作用;5.在SH-SY5Y细胞中过表达DEC1可取消一部分由MPP+诱导的cleaved capase 3/caspase 3的增高,但不影响由MPP+诱导的Bax/Bcl-2增高,同时,过表达DEC1部分取消MPP+引起的TH和DAT表达的降低;6.应用LY294002抑制PI3K/Akt通路,加重了 DEC1在MPP+诱导的细胞凋亡中的表达降低。应用LiCl激活PI3K/Akt通路,取消部分DEC1在MPP+诱导的细胞凋亡中的表达降低;7.在SH-SY5Y细胞中过表达DEC1,我们发现过表达DEC1选择性地部分取消了由MPP+诱导的PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路蛋白的降低。该结果提示DEC1对多巴胺神经元的保护作用与PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路相关。结论:MPTP/MPP+下调DEC1在多巴胺能神经凋亡中与PI3K/Akt通路相关。第二部分:转录因子DEC1缺失对中脑黑质多巴胺能神经元的影响及其机制的研究目的:本文第一部工作结果发现,MPTP/MPP+诱导的多巴胺神经元凋亡是通过下调DEC1表达介导的,提示DEC1与多巴胺神经凋亡相关。本部分研究主要利用两种基因型(DEC1+/+、DEC1-/-)小鼠,研究并探讨DEC1基因缺失对多巴胺能神经元的影响及机制。方法:1)利用不同年龄(四月龄和六月龄)的野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠进行行为学研究(开场实验、爬杆实验、转棒实验和Morris水迷宫实验)。2)用免疫组化方法检测四月龄和六月龄野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠中脑黑质区TH+细胞表达。Western blot方法检测小鼠中脑TH和DAT蛋白表达。3)用尼氏染色方法检测四月龄和六月龄野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠海马和中脑神经元细胞变化。4)用TUNEL染色方法检测四月龄和六月龄野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠中脑凋亡细胞,用Western blot方法检测小鼠中脑凋亡相关蛋白表达。5)应用Western blot方法检测小鼠中脑PI3K/Akt通路相关蛋白(PI3Kp110α、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β、β-catenin)表达。结果:1.与同龄同窝野生型(DEC1+/+)小鼠相比,六月龄基因敲除(DEC1-/-)小鼠在开场实验、爬杆实验和转棒实验中较同年龄的野生型(DEC1+/+)小鼠表现出自主运动能力和运动协调能力障碍;2.四月龄和六月龄同龄同窝野生型(DEC1+/+)小鼠和基因敲除(DEC1-/-)小鼠在Morris水迷宫实验中,学习及记忆能力均没有明显差异;3.六月龄基因敲除(DEC1-/-)小鼠SNpc TH+细胞明显少于同龄同窝野生型(DEC1+/+)小鼠。同时,转录因子DEC1缺失选择性引起六月龄小鼠中脑SNpc神经元细胞缺失,而四月龄基因敲除(DEC1-/-)小鼠则无明显变化;4.六月龄基因敲除(DEC1-/-)小鼠SNpc的细胞凋亡较同龄同窝野生型(DEC1+/+)小鼠明显增多。同时,六月龄基因敲除(DEC1-/)小鼠中脑凋亡相关蛋白caspase3和p53活性较同龄同窝野生型(DEC1+/+)小鼠明显增加,而四月龄基因敲除(DEC1-/-)小鼠则无明显变化。5.与同龄同窝野生型(DEC1+/+)小鼠相比,六月龄DEC1基因缺失小鼠中脑PI3K/Akt 通路相关蛋白(PI3Kp110α、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β、β-catenin)明显降低,而四月龄基因敲除(DEC1-/-)小鼠则无明显变化。结论:DEC1缺失通过PI3K/Akt通路影响caspase 3活性,促进小鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元细胞凋亡。