目的和意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤,其发病与爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染、环境因素以及基因易感性等因素密切相关。鼻咽癌为一种来源于鼻咽上皮的高度恶性的肿瘤,具有高度局部转移及早期远处转移特征。放射治疗和辅助性化疗虽极大的提高了鼻咽癌治愈率,但总体5年平均生存率仍维持在70%左右。大约30-40%患者诊断为晚期鼻咽癌,其中相当一部分患者,经过治疗后的4年内发生远处转移及复发。迄今为止,鼻咽癌发病的分子机制尚未完全阐明。因此,进一步研究鼻咽癌的发病机制及寻找一种可能的早期诊断的分子标志物极为迫切。MicroRNA (miRNA)是一类大小约为19-25个核苷酸(nucleotide, nt)的非编码单链小分子RNA,由具有发夹结构的大小约为70-100nt的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶剪切加工后生成,通过与靶基因mRNA的3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)互补匹配导致该mRNA的降解。大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合,通过转录后抑制翻译来调控基因表达。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,而且绝大部分定位于基因间隔区,其转录独立于其他基因,并不翻译成蛋白质,而是在体内代谢过程中发挥多种调控作用,包括动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、胰岛素分泌、脂肪代谢等多种生命活动。正常细胞的生长、增殖、发育、分化和死亡是一个高度有序的过程,而肿瘤的形成正是这一高度有序的过程发生紊乱所造成的,其发生发展是一个多步骤、多阶段、多因素参与的复杂过程,这一过程涉及到多个基因在时间和空间上的协调表达。除了蛋白编码基因,最近研究发现miRNA在肿瘤的发病机制中发挥及其重要的作用。miRNA作为一类新型基因调控剂,其表达水平在多种肿瘤中发生改变,通过调控下游靶基因的转录和翻译,影响癌细胞的增殖、分化、凋亡、运动、浸润、转移以及血管生成等生物学特性,发挥癌基因或抑癌基因的作用,多角度多层次的参与了肿瘤的演进。目前研究表明,miRNAs不仅存在组织及细胞中,同时存在许多体液,包括血清,血浆,唾液,尿液和羊水。通常把血浆或是血清miRNA认为是循环miRNAs。miRNAs在体液的存在可表示无创癌症生物学标志物。由于失调的miRNA表达的早期事件在肿瘤发生,检测循环miRNA水平也可用于早期癌症诊断和治疗反应的预测以及潜在的新病人选择标准的临床试验中的作用。2008年,首次发现miR-21在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中表达上调,且与患者的无复发生存期密切相关。通过检测的miR-141的血清水平,所以能够区分患者患有前列腺癌的健康受试者。在前列腺癌中15血清miRNAs表达上调,如miR-16, miR-92a和miR-92b等。Tsujiura等研究表明在胃癌患者中,血清miR-21和miR-106B显著高于正常患者,切除胃癌后,血清miR-21和miR-106B表达较术前减少。迄今为止,超过100个研究评估的潜在用途的血清或血浆的miRNA在不同类型的癌症生物标志物。在鼻咽癌中,研究发现众多的microRNAs表达失调,如miR-26a, miR-9, miR-378, miR-10b, miR-144, miR-214等。而这些表达失调的microRNAs参与了鼻咽癌的发生及发展的过程。miR-26在鼻咽癌细胞系及鼻咽癌组织标本中表达下调,靶向EZH2参与抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭作用。同样的,miR-9在鼻咽癌表达下调,并通过靶向CXCR4调控鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。然而,miR-378在鼻咽癌中表达上调,并通过靶向TOB2促进鼻咽癌细胞的增殖,转移及侵袭能力。miR-10b在鼻咽癌细胞系中高表达,下调miR-10b的表达,可抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭能力。截止2015年,约有32个microRNA参与鼻咽癌疾病发生及发展。miRNAs在鼻咽癌发生发展中扮演重要角色,且循环的miRNAs可作为临床无创的检测的生物学标志物。然而在鼻咽癌中,循环miRNA研究报道甚少。因此我们课题组于2013年,利用microRNA-array筛查血浆中的miRNAs表达谱的改变并通过qPCR加以验证,发现鼻咽癌病人的血浆miR-124较非癌病人中表达明显下调。目前为止,miR-124在不同类型肿瘤均有见报道,但miR-124在鼻咽癌组织表达情况及扮演什么角色尚未见研究。因此我们选择miR-124作为我们的研究对象。miR-124全长为21nt,首先从小鼠克隆而来,随后其表达水平在人类胚胎干细胞被证实。2007年,Visvanathan J等发现在胚胎神经系统中,参与了神经突的形成；同时Makeyev EV等证实了促进了神经系统的发育。在肿瘤研究中,Silber J最早发现在miR-124多形性胶质瘤中及在脑肿瘤干细胞中表达明显降低,同时证实miR-124抑制细胞增殖能力。此后miR-124发现在非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等中表达下调,发现miR-124抑制细胞的增殖,转移,侵袭等能力。但在鼻咽癌中,尚未见文献报道。miR-124的表达失调在鼻咽癌的发生发展中又扮演着何种角色及其分子机理等一系列问题都值得我们深入探讨。基于miR-124的研究现状及其在鼻咽癌癌变分子机制中的潜在意义,本课题的研究目的为明确miR-124在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性,探讨miR-124对鼻咽癌细胞生物学特性的影响及其在鼻咽癌发病机制中所发挥的重要作用,阐明miR-124在鼻咽癌中发挥生物学功能的分子机理,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。材料和方法1.细胞培养人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE-1和SUNE-1采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗RPMI 1640培养基,NP69采用KMSF培养基,HK-293T细胞采用DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养。采用对数期生长的细胞用于实验。2.临床标本收集178例鼻咽癌组织和55例非癌鼻咽上皮组织均来源于南方医院耳鼻喉科标本库,所有标本均为鼻咽部活检组织,经病理确诊为鼻咽癌,所有患者均尚未接受放化疗治疗。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3.载体构建[1]慢病毒载体pLVTHM/miR-124该载体经慢病毒包装、感染细胞后可稳定过表达miR-124,通过Real-time PCR及基因测序证实该载体构建成功。[2] psicheck.2-Foxql wt 3’UTR和psicheck.2-Foxql mut 3’UTR以正常人外周血基因组DNA为模板,扩增Foxql 3’UTR (185bp),将该片段克隆到psicheck.2-control vector,得到重组质粒psicheck.2-Foxql wt 3’UTR,然后将该重组质粒进行定点突变,得到突变质粒psicheck.2-Foxql mut 3UTR。[3]过表达的Foxq1慢病毒购买于上海吉玛生物技术有限责任公司。4.细胞转染[1] miRNA瞬时转染：采用阳离子脂质体法进行瞬时转染,操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。[2] 慢病毒感染将慢病毒悬液感染鼻咽癌细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光(green fluorescent protein, GFP)发光情况。利用流式细胞仪进行细胞分选获得GFP阳性细胞,分别建立过表达miR-124、过表达Foxql鼻咽癌细胞株。5. miRNA与质粒共转染：操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。24孔板中miRNA的转染量为50nM,重组质粒psicheck.2-Foxq1 wt 3’UTR和psicheck.2-Foxq1 mut 3’UTR的转染量为100ng。6.荧光定量PCR抽提细胞和组织的总RNA和小分子RNA,逆转录成cDNA后,采用sybr green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。7. Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10% SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、化学发光法显影。8.双荧光素酶活性检测将荧光素酶报告基因载体瞬时转染24h后,将细胞裂解,然后利用GloMaxTM 96 Microplate Luminometer发光检测仪分别测定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。以Firefly luciferase与Renilla luciferase活性的比值作为荧光素酶的相对活性,进行不同样品间的比较。9.细胞生物学实验[1] CCK-8细胞增殖实验将1x103个细胞接种于96孔板中,每孔体积200μl,每组5孔,同时设空白对照,分别培养24h、48h、72h和96h。每孔加入CCK-8溶液10μl,37℃孵育2h后终止孵育,以空白对照孔调零,酶标仪上450nm测定各孔吸光度值(OD值),以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。[2] 平板克隆形成实验接种100个细胞到12孔板中,保证细胞分散均匀,培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去培养基,多聚甲醛固定后结晶紫染色,显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。[3] 细胞周期检测采用碘化丙锭(propidium iodide, PI)单染法检测细胞周期分布。将细胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式细胞仪检测。[4] 细胞迁移实验 将细胞重悬于无血清的RPMI-1640培养基中,每个Transwell小室中加入细胞,培养板每孔加入10%胎牛血清培养基,培养24h后取出Transwell小室,固定染色显微镜下观察穿过膜的细胞。[5] 细胞侵袭实验Matrigel基质胶冻融后,向Transwell小室中均匀加入50ul,37℃培育12h后,余操作同细胞迁移实验。10.动物实验[1]裸鼠皮下成瘤实验分别将过表达miR-124的lv-miR-124/5-8F和对照组细胞lv-miR-Ctrl/5-8F随机接种于12只裸鼠后背部皮下,接种细胞数为5×105,每组包括6只。每两天用游标卡尺测量肿瘤的长短径一次,按如下公式计算肿瘤体积：v=(Dxd2)/2,其中D代表肿瘤最长径,而d代表肿瘤最短径。待肿瘤体积超过500mm3,将实验动物处死,肿瘤组织取出后经福尔马林固定,石蜡包埋,切片后HE染色,光学显微镜观察。[2]肝癌肺转移模型分别将过表达miR-124/Iv-miR-124/5-8F和对照组细胞lv-miR-Ctrl/5-8F随机接种于10只裸鼠的肝包膜下,接种细胞数为1x106,每组包括5只。25天后,给予裸鼠安乐死后,取出裸鼠的肝脏及双肺,通过光学显微镜、荧光显微镜及免疫组化观察肝脏及双肺转移瘤情况。11.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,免疫组化的检测结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野,如果核阳性的肿瘤细胞数超过50%,则认为该样本阳性。然后,按照细胞染色强度进行评分：棕褐色(3分),棕黄色(2分),淡黄色(1分),无着色(0分)。12.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,CCK-8细胞增殖实验和动物实验皮下成瘤体积的比较采用析因设计的方差分析；免疫组化染色强度的比较采用Mann-Whitney U检验；鼻咽癌组织中miR-124和Foxql表达水平的相关性分析采用Spearman相关分析；其他实验中涉及到两组数据之间的比较均采用两独立样本的t检验,而三组或三组以上数据的比较采用单因素方差分析,方差齐性时,采用ANOVA,其多重比较采用LSD法；方差不齐时采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett T3。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.miR-124在鼻咽癌细胞株及鼻咽癌组织标本中表达及临床特征分析荧光定量PCR结果显示,在7种鼻咽癌细胞株,即5-8F、6-10B、CNE1、 CNE2、C666-1、HONE1和SUNE-1, miR-124的表达均低于永生化鼻咽上皮细胞NP69；而在178例非角化未分化型鼻咽癌组织中,miR-124的平均表达水平要比55例鼻咽慢性炎组织降低60%(t=4.906, P<0.001)。miR-124表达与鼻咽癌患者的性别及年龄无明显相关性。我们发现miR-124与临床分期密切相关,临床分期越晚,miR-124的表达水平越低。同时也与患者的T分期相关,T分期越晚,miR-124的表达水平越低。上述实验结果表明,miR-124在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,且与鼻咽癌的临床分期、T分期密切相关,为进一步研究其生物学功能提供了初步依据。2.miR-124过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响选取鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B作为细胞学模型,研究miR-124表达改变对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。首先,瞬时转染miR-124 mimics和miR-Ctrl,荧光定量PCR检测miR-124表达的改变,结果发现,在5-8F和6-10B中转染miR-124 mimics后,miR-124的表达分别增高了114.15倍和60.99倍;该结果显示,瞬时转染miR-124 mimics可有效上调miR-124的表达。通过CCK-8实验和细胞周期检测观察miR-124表达改变对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。CCK6-8实验结果发现,转染miR-124 mimics 96h后,5-8F和6-10B细胞的生长速度分别降低了36.5%和40.3%(5-8F:F=214.753,P<0.001; 6-10B:F=220.420, P<0.001)。细胞周期分布显示,在5-8F细胞中,与对照组相比,miR-124 mimics转染后使G1期细胞比例显著增高17.4%(t=25.860,P<0.001),S期细胞比例显著减少(t=19.452,P<0.001)。在6-10B细胞中,与对照组相比,miR-124 mimics转染后使G1期细胞比例显著增高16%(t=20.086,P<0.001),S期细胞比例显著减少(t=14.769,P<0.001),G2+M期细胞比例无显著改变。该结果表明,miR-124过表达通过诱导细胞周期G1期阻滞,抑制鼻咽癌细胞增殖。通过细胞迁移实验及细胞侵袭实验评估过表达miR-124对5-8F及6-10B细胞转移功能影响。细胞迁移实验结果显示,miR-124过表达使5-8F及6-10B迁移能力下降76%(t=30.948,P<0.001)、54% (t=20.100,P<0.001)。细胞侵袭实验发现,miR－124过表达使5-8F及6-10B侵袭能力下降65.8%(t=26.929,P<0.001)、62.6% (t=19.759,P<0.001)。结果表明,miR-124过表达抑制鼻咽细胞株的迁移及侵袭能力。在此结果的基础上,为了进一步研究miR-124对鼻咽癌细胞的生物特性的影响。我们构建miR-124慢病毒表达载体,依据慢病毒载体所携带的GFP标记,采用流式细胞仪分选(fluorescence activated cell sorter, FACS)获得GFP阳性细胞群,建立稳定过表达miR-124的鼻咽癌细胞株lv-miR-124/5-8F和lv-miR-124/6-10B。利用稳定表达的miR-124的细胞株,通过平板克隆形成实验检测了miR-124过表达对癌细胞克隆形成能力的影响。结果发现,miR-124过表达使5-8F和6-10B细胞的克隆形成率分别降低46%(t=7.190,P=0.002)和33%(t=4.051,P=0.015)。为进一步研究miR-124过表达对鼻咽癌细胞体内成瘤的能力影响,我们还将lv-miR-124/5-8F细胞接种裸鼠皮下,建立鼻咽癌异位移植瘤模型。结果表明,接种后第7天成瘤的能力出现显著性差异,lv-miR-124/5-8F细胞所形成的肿瘤体积显著小于对照细胞(P<0.001)。至第15天,接种lv-miR-124/5-8F细胞形成的肿瘤体积比对照组细胞的肿瘤体积降低(t=-6.149,P<0.001),且免疫组化结果发现,miR-124过表达后显著降低了Ki-67和PCNA的表达(Ki67:Z=3.878, P<0.001; PCNA:Z=5.300, P<0.001)。此外,我们建立了肝包膜下移植瘤肺癌转移模型评估miR-124过表达对鼻咽癌细胞体内转移的能力影响。结果表明,肝包膜下种植lv-miR-124/5-8F,25天后,肝脏局部转移及肺转移个数明显较对照组lv-Ctrl/5-8F减少。以上结果显示,miR-124参与了鼻咽癌的发病机制,其表达失调与鼻咽癌细胞的体外增殖及转移能力和体内成瘤及转移能力密切相关,在鼻咽癌中扮演候选抑癌基因角色。3.miR-124抑制鼻咽癌细胞增殖及转移相关分子机理的探讨利用PicTar、TargetScan和PITA三大数据库对miR-124进行靶基因预测,我们从众多的靶基因中选择出来27个与肿瘤增殖及转移密切相关的基因。在lv-miR-124/5-8F细胞中,利用PCR检测候选的27个靶基因发现,Foxq1较其他26个基因明显下调,同时Westernbolting实验证实了过表达miR-124下调Foxq1的表达。我们检测了7株鼻咽癌细胞株及NP69中Foxq1的mRNA水平及蛋白水平,结果发现,在鼻咽癌细胞株中,Foxql的表达较NP69明显上调。因此选择Foxq1为miR-124的候选靶基因,结果可靠。于是,我们构建了重组质粒psicheck.2-wt Foxql 3’UTR和突变质粒psicheck.2-mut Foxql 3’UTR,以便进行双荧光素酶报告基因实验。将上述重组质粒和miR-124 mimics、miR-Ctrl共转染5-8F及HK-293T细胞,检测荧光素酶活性,结果发现psicheck.2-wt3’UTR和miR-124 mimics共转染可显著降低荧光素酶的活性(t=7.744,P<0.001),表明miR-124与Foxq1 3’UTR可特异性结合。在以上结果的基础上,转染shFoxq1下调5-8F的Foxq1表达,观察Foxq1下调对鼻咽癌细胞增殖、迁移及转移的能力影响。CCK-8实验结果表明,Foxq1沉默后使5-8F细胞的增殖能力降低35%(F=43.89,P<0.001),细胞迁移实验表明,Foxql沉默后使5-8F细胞的迁移能力降低33.9%(t=13.155,P<0.001),细胞侵袭实验表明,Foxq1沉默后使5-8F细胞的侵袭能力降低44.9%(t=-17.13,P<0.001), Foxq1沉默后与miR-124过表达引起类似的抑制作用。与此同时,Foxq1沉默后使6-10B细胞取得相似的结果。随后,我们干扰Foxq1观察其对鼻咽癌细胞的抑制作用是否与过表达miR-124一致,结果发现,干扰Foxq1可以取得与过表达对鼻咽癌细胞的增殖、迁移及转移类似的结果。此外,我们在Iv-miR-124/5-8F细胞中进一步过表达Foxq1,结果发现转染96h后Foxq1过表达可显著逆转miR-124的增殖抑制作用(F=36.7,P<0.001)；同时,Foxq1过表达可显著逆转miR-124的迁移抑制作用(t=20.65,P<0.001)及侵袭抑制作用(t=14.313,P<0.001)。该结果表明,miR-124抑制鼻咽癌细胞增殖及转移的生物学功能是通过调控Foxq1的表达来实现的。4.鼻咽癌组织标本中Foxq1与miR-124表达之间的相关性利用PCR在178例非角化未分化型鼻咽癌组织中,Foxq1的平均表达水平要比55例鼻咽慢性炎组织升高60%(t=16.910,P<0.001)。我们发现Foxq1与临床分期密切相关,临床分期越晚,Foxq1的表达水平越高。同时也与患者的T分期相关,T分期越晚,Foxq1的表达水平越高。miR-124的表达水平与Foxq1表达水平密切相关(r=-0.565,P<0.001)。同时,组织免疫组化实验证实了Foxq1随着临床分期的增加表达增加,与PCR结果类似(r=-0.605, P<0.001)。Foxq1组织中免疫组化的水平与miR-124表达密切相关。综合以上结果,阐明了miR-124通过调控靶基因Foxq1抑制鼻咽癌细胞增殖及转移。结论1.miR-124在鼻咽癌细胞株和组织中表达下调,且与鼻咽癌的临床分期,T分期成负性相关性。2. miR-124在体外细胞实验抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及转移能力；同时,在裸鼠皮下成瘤实验中,抑制鼻咽癌的细胞增殖能力,在肝癌肺转移模型中,抑制鼻咽癌的转移能力,发挥候选抑癌基因的功能。3.在鼻咽癌细胞系中,Foxq1表达上调,同时促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移及转移能力；miR-124靶向Foxq1调节鼻咽癌细胞的增殖、迁移及转移能力。4. Foxq1在鼻咽癌组织中表达上调,与临床分期及T分期成正性相关；与miR-124表达呈负性相关。