大蒜植株中蒜氨酸酶的分离及酶学特性研究

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大蒜植株中主要功能物质是由蒜氨酸酶催化蒜氨酸产生的极不稳定的大蒜素等含硫化合物。本试验以大蒜植株为原料,依次采用Na+/K+磷酸缓冲溶液浸提法、PEG8000沉淀法、超滤浓缩法、SephadexG-75色谱柱层析法分离纯化出蒜氨酸酶,并采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其纯度;以蒜氨酸为底物研究蒜氨酸酶的酶学特性;并对蒜氨酸酶解产物的抗氧化性及抑菌活性进行了研究。主要结果如下:蒜氨酸酶的分离纯化工艺为:pH7.0的Na+/K+磷酸缓冲溶液浸提蒜氨酸粗酶液,加入15%PEG8000去除部分杂蛋白,再在上清中加入PEG8000使其终浓度为25%,取沉淀;用截留分子量为30K的中空纤维膜,压力为0.1MPa,缓冲溶液循环超滤两次;通过Sephadex G-75色谱柱进行纯化。并经过SDS-PAGE电泳显示其纯度得到提高。蒜氨酸酶的酶学特性为:最适温度50℃,最适pH6.5,米氏常数Km=2.38mmol·L-1, Vmax=1.05μnol·min-1;蒜氨酸酶在温度为30℃时相对稳定,pH在6-9条件下相对比较稳定;Mg2+、EDTA-Na、Fe3+、甘油、PLP、葡萄糖对酶促反应有激活作用,Ba2+Ca2+、Co2+、Cu2+、L-半胱氨酸对酶促反应有抑制作用;蒜氨酸酶的糖含量为7.65%,且糖肽键连接方式是N-型连接。不同活力单位的酶处理蒜氨酸的产物可提高蒜氨酸样品的总抗氧化能力及对DPPH·、羟自由基的清除能力;酶处理的蒜氨酸样品对DPPH·、羟自由基的清除能力与处理时间成反相关,酶处理时间对其总抗氧化能力影响不大。酶处理的蒜氨酸样品对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌4种菌均有不同程度的抑制作用,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用相对较强,对变形杆菌的次之,对金黄色葡萄球菌的抑制能力相对较弱。
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