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呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是世界范围内婴幼儿最重要的病毒性下呼吸道感染病毒病原,目前现代医学尚无特效的抗RSV药物,相关疫苗的开发也尚未成熟。Delgado, M. F.等2009年在《Nat Med》中提出,灭活的RSV疫苗是确保婴幼儿接种疫苗安全性的关键因素,因其通过Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)的刺激可增强保护性抗原表位的抗体亲和力。TLRs作为重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)类型,在RSV感染过程中发挥着重要的作用,它能识别出不同微生物的病原相关分子模式(pathogen associated molecule pattern, PAMP),是研究RSV感染的新的方向。中医药以辨证论治及整体观念为基础,提出清肺、化痰、止咳等一系列具有中医特色的抗RSV感染的方法,并取得良好的临床疗效,导师汪受传教授带领的团队承担的国家自然科学基金项目“金欣口服液对RSV活化的TLRs信号转导通路作用机制研究(81072840)”,前期研究成果已证实金欣口服液能够调控RSV感染活化诱导的TLR3(sTLR3)、TLR7(sTLR7)及部分TLR4(sTLR4)下游信号分子的表达水平。金欣口服液有明显抑制RSV的作用,病毒的F蛋白或其受体可能是其作用位点；这些研究结果为治疗婴幼儿RSV肺炎提供了新的思路。鉴于中医药的多靶点作用,本实验从TLR4及其介导的信号通路入手,采用RNA干扰(RNAi)技术,探讨金欣口服液抗对RSV诱导的TLR4信号转导通路的调控,及与其它TLRs的相关性。1目的研究金欣口服液对RSV诱导的TLR4信号传导通路的调控作用,并从微观角度探讨金欣口服液治疗RSV肺炎的免疫学机制。2方法体外实验：采用金欣口服液含药血清进行干预体外培养的受RSV感染的RAW264.7细胞,24h后收集细胞,并用TLR4siRNA干扰后检测TLR4及转化生长因子p活化激酶(TAK1)相关指标,观察转染后的金欣口服液对RAW264.7细胞TLR4mRNA、TAK1mRNA水平及蛋白表达的影响,观察金欣口服液对RSV诱导的TLR4传导通路影响及与其它TLRs信号通路的相关性。体内实验：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液进行干预,并于首次滴鼻后24小时,取小鼠肺组织,行病理组织切片以评价肺部病变情况,并运用Western Blot法检测小鼠肺组织TLR4, TAK1蛋白表达情况。3结果3.1体外实验3.1.1TLR4siRNA转染后(1)TLR4siRNA转染RAW264.7细胞干扰了TLR4的表达。转染后,TLR4mRNA的表达下降了0.456倍,表明用TLR4siRNA转染RAW264.7细胞千扰TLR4mRNA的生成模型复制是成功的。RSV组TLR4mRNA的表达较正常组下调明显,金欣口服液组与RSV组相比TLR4mRNA的表达有所上升(ΔP<0.05),故金欣口服液含药血清可上调RSV诱导的TLR4mRNA的表达。(2)TLR4siRNA转染RAW264.7细胞后,可见TAK1mRNA的表达有所下调,RSV感染后,TAK1mRNA的表达下降了0.632倍,与转染组相比利巴韦林与金欣含药血清均可上调TAK1mRNA的表达(▲▲P<0.01),金欣口服液组和利巴韦林组与RSV组相比表达有所上升(P<0.01),且金欣口服液上升更明显。(3)使用TLR4siRNA转染RAW264.7细胞干扰了TLR4的表达,转染后,可见TLR4蛋白表达明显下调,RSV组与TLR4siRNA转染组相比蛋白表达存在差异(P<0.01)。与转染组相比利巴韦林注射液、金欣含药血清均可上调TLR4蛋白的表达,且金欣口服液的上调较利巴韦林明显(P<0.05)(4)转染后,RSV感染RAW264.7细胞可见TAK1蛋白存在明显的改变,转染组较正常组有明显下调(P<0.01),RSV感染组较转染组有所下调(P<0.01)。利巴韦林、金欣含药血清可下调TAK1蛋白的表达(P<0.01),但利巴韦林组下调更加明显,两者之间差别具有统计学意义(P<0.05)。3.2体内试验3.2.1RSV感染24小时后BALB/c小鼠肺脏病理结果显示金欣口服液组肺内炎症均有不同程度减轻,病理评分结果显示治疗组各时间点与RSV感染组相比均有统计学显著性差异(P<0.05)。3.2.2金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠肺组织TLR4、TAK1表达的影响：RSV感染24h后,TLR4、TAK1蛋白的表达与正常照相比明显升高(P<0.01),而与RSV感染组相比,金欣口服液则能降低RSV感染后TLR4、TAK1蛋白表达水平(P<0.05),效果优于利巴韦林组(P<0.01),同时根据Pearson相关系数r=0.980、P=0.000<0.01,我们可以认为TLR4与TAK1的蛋白表达呈正向直线相关。4结论4.1金欣口服液对减轻RSV感染小鼠的肺部炎症具有明显效果,并且在疾病早期其作用略优于利巴韦林。4.2金欣口服液能抑制TLR4信号转导通路中TLR4/TAK1蛋白的表达,而TLR4的蛋白表达与TAK1的蛋白表达呈正相关,二者呈平行抑制关系,也就是说金欣口服液发挥抗RSV作用机制中的TLR4信号通路途径可能是通过TAK1来发挥作用的4.3TLR4siRNA转染后,TLR4mRNA及蛋白表达明显受抑,TAK1mRNA及蛋白表达也明显受抑,表明TAK1的表达受TLR4调控,同时转染后金欣口服液组TLR4mRNA及蛋白表达有所上调,证明了其它信号通路可能对TLR4通路也存在一定的影响,TAK1通路并非是TLR4信号通路的唯一途径。4.4金欣口服液发挥抗RSV作用机制中的TLR4信号通路途径可能是通过TAK1来发挥作用的,即TLR4/MyD88/TAKl/NF-κB/TNF-α途径。