蛋白质磷酸化是常见的蛋白质翻译后修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。鉴别磷酸化蛋白质并对其进行结构分析已经成为蛋白质鉴定工作中非常重要的部分，对磷酸化蛋白质的规模化分析和位点鉴定更是当前磷酸化蛋白质组研究面临的技术挑战。但由于磷酸化修饰的低丰度、动态、可逆的特点，以及磷酸化多肽的低离子化效率，开发磷酸化多肽的富集方法及相关鉴定技术，具有非常重要的意义。　　本论文的工作主要集中在磷酸化多肽的富集和快速筛查方法的研究。具体如下:　　(1)本文首先报道了一种新型的磷酸化多肽简便、快速、高效的富集方法。使用天然纳米材料膨润土进行富集，并使用MALDI-TOF MS进行检测。膨润土是一种天然含铝纳米材料，具有无毒，廉价易得以及良好的生物兼容性等特点。将膨润土应用到磷酸化多肽的富集当中，简单洗涤之后即可对富集在膨润土表面的磷酸化多肽直接检测，省去了繁琐的纳米材料制备、除盐以及洗脱过程。整个富集过程10分钟内即可完成。将此方法应用在几种标准蛋白以及牛奶酶解液中磷酸化多肽的富集，低飞摩尔级别的样品，α-酪蛋白和β-酪蛋白的所有磷酸化位点的酶解多肽均可被检测到，充分体现了膨润土的优异富集能力。与MALDI-TOF MS检测技术联用，可以快速高通量的对磷酸化多肽进行检测，为天然纳米材料膨润土打开了更广阔的应用前景。　　(2)IMAC技术在磷酸化多肽的富集中有着非常重要的应用，但现有洗脱试剂为了提高洗脱效果，通常含有大量的盐分，在质谱检测前必须除去。在本文中，报道了一种新型的Fe-NTA小柱洗脱液草甘膦缓冲液。其具有固有离子化程度低，质谱检测前无需除去且与Fe3+有良好配位能力的特点。溶液自身呈酸性，可以选择性洗脱单磷酸化多肽，负离子形式（pH9，氨水调节pH）则可以洗脱所有的磷酸化多肽。此外，草甘膦氨水缓冲液的高离子强度可以抑制洗脱过程中非专一性静电相互作用，抑制金属离子与磷酸化多肽加和离子的生成（如Na+或Fe3+）。回收率明显高于其他常用洗脱剂，MALDIMS检测时，磷酸化多肽的S/N可以提高3-5倍。将此试剂应用到IMAC技术中，可以大大缩短实验时间、操作步骤和实验成本，对磷酸化多肽的富集与检测具有非常重要的意义。　　(3)在使用离子淌度质谱对磷酸化多肽进行分析时，我们发现了一种快速识别假阳性磷酸化多肽异构体的方法。对于10个氨基酸以上的胰蛋白酶解磷酸化肽段，由于N端残基以及酶解位点赖氨酸或精氨酸残基的存在，通常至少可以带上2个电荷。若同一质荷比离子含有多个漂移条带，通过综合分析肽段不同质荷比离子的漂移条带数目之间的关系、氨基酸等电点组成以及空间电荷效应，可判断多个漂移条带是否是由于带电位点不同引起，从而减少磷酸化多肽异构体的误判，对蛋白质组学分析中遇到的序列相同但具有多个漂移点的肽段性质快速判断、磷酸化多肽异构体的快速筛查具有非常重要的意义。