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新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的体外分离及其鉴定目的:建立新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞体外分离及其培养与鉴定的方法。方法:选用健康新生大鼠,解剖显微镜下取出双侧耳蜗,除去基底膜及蜗轴的神经纤维组织,胰蛋白酶消化后种植于DMEM/F12培养液,四天后,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,应用抗神经微丝蛋白单克隆抗体对耳蜗螺旋神经节细胞进行免疫细胞组织化学染色鉴定。结果:按本方法分离可获得存活状态良好的细胞,经免疫组织化学鉴定证实为耳蜗螺旋神经节细胞。结论:此方法可以得到内耳耳蜗螺旋神经节细胞,其细胞数量及活性状态可满足膜片钳记录等体外实验研究的需求。第二部分大鼠耳蜗螺旋神经节细胞电压依赖性钾通道的研究目的:体外分离大鼠耳蜗螺旋神经节细胞,记录耳蜗螺旋神经节细胞膜钾电流并探讨其特性。方法:利用全细胞膜片钳技术记录钾电流,从药理学和动力学两方面观察钾通道特性。结果:在室温条件下可记录到典型的全细胞电压依赖性钾电流(IK)及延迟整流钾电流(IKDR),IK和IKDR均为外向电流,激活电压分别为-60mV和-50mV;随着去极化程度增加而增加,能被已知的钾通道的阻断剂4-AP和TEA-Cl阻断,IK和IKDR的半数最大激活膜电位(V1/2)分别为(25.25±2.15)mV(n=10)和(18.65±1.88)mV(n=10)。结论:通过急性分离方法得到的耳蜗螺旋神经节细胞形态及生理特性良好,较好地表达了电压依赖性钾离子通道的特性,适合做进一步的药理学及电生理研究。第三部分顺铂对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流的影响目的:观察记录顺铂作用下急性分离新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(Spiral Ganglion Neurons)延迟整流钾通道的电流曲线,分析顺铂(Cisplatin)对耳蜗螺旋神经节细胞钾电流激活动力学的影响,并初步探讨其耳毒性机制。方法:采用全细胞膜片钳技术记录耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流及顺铂对此电流的影响。结果:钳制电压为-60mV,刺激电压从-80 mV到+60mV逐渐去极化,阶跃电压为10 mV,持续时间为500ms。可在耳蜗螺旋神经节细胞上记录到外向钾电流,该电流对TEA-Cl(4-乙基胺)敏感,具有延迟整流特性;在细胞外液中加入10μmol/L顺铂,能明显抑制耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流,+50 mV的去极化电压刺激后引出的最大稳态电流幅值减少了23.3%;顺铂对此电流的抑制作用与细胞外液中顺铂的浓度呈剂量依赖性,即顺铂浓度越大,对电流的抑制作用越大;外液洗脱后耳蜗螺旋神经节细胞IKDR电流可基本恢复正常。结论:顺铂可抑制耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流,钾通道与耳蜗螺旋神经节细胞动作电位的产生密切相关,抑制钾通道后动作电位产生受到抑制,听觉信息传导功能受损,导致听觉功能障碍,从电生理角度阐述了顺铂耳毒性部分机制。