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目的:通过研究神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和胰岛素对糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)中NGF表达情况的影响,分析糖尿病膀胱病变(diabetic cystopathy,DC)的发病机制及NGF和胰岛素的治疗作用,为在血糖有效控制的情况下应用NGF治疗DC提供充分的实验依据。方法:成年雄性Wistar大鼠35只,体重180～220g,随机选取7只大鼠,腹腔注射50mg/kg的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液作为正常对照组(NC组),分别在1、4和8周时测尾静脉血葡萄糖浓度(blood glucose,BG),以排除糖尿病大鼠(BG>16.7mmo1/L)。参照Schmeichel等方法,将剩余的大鼠在造模前一天晚禁食不禁水12小时,然后一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素(50mg/kg,0.1mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制而成,PH4.2～4.5)诱发糖尿病,注射STZ72小时后用血糖仪测尾静脉血葡萄糖浓度。BG>16.7mmo1/L者确定为糖尿病大鼠模型成功。结果共有26只大鼠造模成功。大鼠造模成功后给予普通饲料喂养,自由进食饮水。饲养4周后剩余24只,将其随机分成4组,即:DC组6只、DC单用NGF组(NGF组)6只、DC单用胰岛素组(RI组)6只、DC联合应用NGF和胰岛素组6只(NGF+RI组,胰岛素通过颈部皮下注射给药, NGF通过腹腔内注射给药)。将大鼠分别给予不同的处理:每天1次,共4周。造模成功8周后进行实验,再次检测除NC组外的各组大鼠尾静脉血葡萄糖浓度,BG≤16.7mmol/L者仍被排除。实验前1天将大鼠放入代谢笼测定24小时尿量。实验当天测大鼠体重,实验切取完整膀胱和两侧腰6骶1DRG,称量膀胱湿重。并取每只大鼠的部分膀胱和一侧腰6骶1DRG分别置于4%的戊二醛固定液中进行电镜观察。将剩余的膀胱和腰6骶1DRG置于4%多聚甲醛溶液中固定,苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察糖尿病大鼠膀胱逼尿肌和腰6骶1DRG的形态学变化。采用免疫组织化学方法检测膀胱逼尿肌细胞和腰6骶1DRG神经元中NGF的表达情况。光镜下观察结果,膀胱逼尿肌细胞内或腰6骶1DRG神经元内含有棕黄色颗粒为阳性细胞。以阳性细胞染色的平均光密度值(OD值)来表示NGF的表达量。通过Motic Med 6.0数码医学图像分析系统在相同的放大倍数下对免疫组化结果进行半定量分析。在高倍视野(×200)下观察,每张切片随机取6个位置相应、不重复的视野(每只大鼠取3张切片,每张切片观察2个高倍视野),取6个视野均值作为该片平均光密度值(OD值),每样本两张切片均值作为该样本实验结果。统计学处理:所有计量资料用均数±标准差( x±s)表示,两两均数的比较采用t检验或t’检验,多个均数的比较采用单因素方差分析(one way analysis of variance, one way ANOVA),并用Q检验进行组间比较,使用SAS 8.0统计软件处理。统计学意义:设定P>0.05为无显著性差异;P<0.05表示差异具有显著性;P<0.01表示存在极显著差异。结果:1 DC组与NC组体重、血糖、24小时尿量、膀胱湿重的比较造模成功8周后即治疗4周后,DC组大鼠体重、血糖、24小时尿量、膀胱湿重与NC组相比分别为:(219.5±11.06g)vs(309.7±8.38g)(t=-16.73 P<0.01);(30.9±2.33mmol/L)vs(4.3±0.18mmol/L)(t=30.33 P<0.01);(90.63±5.00ml)vs(21.33±2.08ml)(t=33.65 P<0.01);(171.97±4.32mg)vs(136.19±3.47mg)(t=16.57 P<0.01)明显高于NC组。2透射电镜结果正常对照组:逼尿肌细胞分布均匀,形态相似,走行整齐,细胞间连接紧密,胞饮小泡在肌质膜下的分布较多,细胞内线粒体大小形态正常,基质密度正常,致密体分布均匀;腰6骶1DRG中神经髓鞘均匀一致,成同心圆形排列,胞浆均匀,神经胶质正常。实验组:逼尿肌细胞分布杂乱,形态多样,走行紊乱,细胞之间的中间连接减少,常常被胶原纤维和无定形成分所填充,胞饮小泡在肌质膜下的分布变少,细胞内线粒体肿胀,嵴稀疏、断裂、甚至消失,基质密度降低,致密体分布杂乱;腰6骶1DRG中神经髓鞘水肿、变性、断裂、甚至脱落,神经胞浆空泡变性,神经胶质空泡变性。以上表现在DC组表现最严重,在RI组和NGF组表现相对较轻,在NGF+RI组表现不明显,其与正常对照组表现较相似。3免疫组化结果分析光镜下观察正常对照组与实验组大鼠膀胱逼尿肌和腰6骶1DRG结构表现。(1)正常对照组:HE染色可见横行及纵行切断的肌束排列整齐,结构紧密,间隙充满结缔组织。固有膜完整,粘膜下及肌间神经束多见。免疫组化染色可见逼尿肌细胞大小形态均匀一致,肌纤维排列整齐,细胞间结构紧密。神经元细胞大小形态均匀一致,排列整齐,细胞间结构紧密。(2)实验组: HE染色可见逼尿肌肌束排列松散紊乱,肌束间隙明显增宽,间隙间并未被结缔组织充满,肌束间胶原纤维减少。肌束之间的小血管充血,可以看见神经束。免疫组化染色可见逼尿肌细胞肥大,形态多样,排列紊乱,细胞间结构松散。神经元细胞排列松散紊乱,细胞水肿且形态多样,间质增生,细胞间结构松散。以上表现在DC组表现最严重,在RI组和NGF组表现相对较轻,在NGF+RI组表现不明显,其与正常对照组表现较相似。4 NGF在膀胱壁中表达的比较采用SP免疫组织化学染色检测NC组、DC组、RI组、NGF组和NGF+RI组大鼠膀胱逼尿肌细胞中NGF的表达情况。光镜下观察结果,大鼠逼尿肌细胞内含有棕黄色颗粒者为阳性细胞。糖尿病大鼠膀胱逼尿肌细胞中NGF的表达比正常对照组明显减少;NGF组、NGF+RI组大鼠膀胱逼尿肌细胞中NGF的表达均明显高于DC组(P<0.05);同时NGF组、RI组与NGF+RI组之间NGF的表达均有显著性差异(P<0.05)。5 NGF在腰6骶1DRG神经元中表达的比较采用SP免疫组织化学染色检测NC组、DC组、RI组、NGF组和NGF+RI组大鼠腰6骶1DRG神经元中NGF的表达情况。光镜下观察结果,腰6骶1DRG神经元中含有棕黄色颗粒为阳性。糖尿病大鼠腰6骶1DRG神经元中NGF的表达比正常对照组明显减少;NGF组、NGF+RI组大鼠腰6骶1DRG神经元中NGF的表达均明显高于DC组(P<0.05);同时NGF组、RI组与NGF+RI组之间NGF的表达均有显著性差异(P<0.05)。结论:1、NGF治疗糖尿病膀胱病变大鼠,能明显改善其膀胱病变。2、NGF治疗糖尿病膀胱病变大鼠,能明显增加膀胱和腰6骶1DRG中NGF含量。3、NGF和胰岛素联合治疗糖尿病膀胱病变大鼠时,有协同作用。