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研究背景及目的冠心病所致心肌缺血以及溶栓、支架植入等临床治疗所伴随的再灌注损伤严重影响冠心病的预后。如何在有效恢复心肌血流灌注的同时降低心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）损伤，一直是有待突破的医学研究热点。活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）及其介导的氧化应激和随之造成的线粒体损伤是MI/R损伤的重要机制之一。MI/R损伤中线粒体电子传递链酶系和NADPH氧化酶系（nadph oxidases，Noxs）是ROS的两大主要供体，并且它们之间相互关联、相互影响。一些研究发现Nox2和Nox4能够诱导ROS的大量生成，在多种心脏疾病模型中发挥了明显的损伤作用。然而，最近相继有研究显示Nox4在心脏受到慢性应激时扮演了重要的保护性角色。目前对Nox4的研究多集中在血管病理性损伤、心肌肥厚和心衰等，在MI/R损伤中的研究则少有报道。因此，本研究以H9C2心肌细胞系为研究对象，建立体外缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，采用RNAi方法下调Nox4的表达，以明确内源性Nox4在心肌细胞H/R损伤中的作用及相关机制，为临床防治MI/R损伤提供实验依据和新的研究方向。实验方法实验一：建立H9C2心肌细胞H/R模型，探讨内源性Nox4在H/R损伤中的作用。1.建立H/R模型，采用RNAi的方法下调Nox4的表达，将H9C2心肌细胞随机分为control组、NC-siRNA组、Nox4-siRNA组、H/R组、H/R+NC-siRNA组和H/R+Nox4-siRNA组。2.分别采用Western blot法测定各组Nox4表达水平、四甲基偶氮唑蓝法（methylthiazolyl tetrazolium， MTT）测定细胞生存率、原位末端转移酶标记技术（erminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）检测细胞凋亡、分光光度法检测caspase-3活性、DCFH-DA荧光探针检测胞浆内ROS含量以及比色法测定丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）水平。实验二：明确内源性Nox4在H9C2心肌细胞H/R损伤中发挥心肌保护作用的机制。1.建立H/R模型，采用RNAi的方法下调Nox4的表达，将H9C2心肌细胞随机分为control组、NC-siRNA组、Nox4-siRNA组、H/R组、H/R+NC-siRNA组和H/R+Nox4-siRNA组。2.分别采用MitoSOX荧光探针检测线粒体ROS、JC-1荧光探针分析线粒体膜电位水平、荧光素酶化学发光法测定ATP含量、比色法测定NAD+/NADH的比值、Western blot法测定Sirt3蛋白表达水平。实验结果1.与control组相比，H/R组H9C2心肌细胞的Nox4表达量明显升高(P<0.01)，细胞生存率降低(P<0.01)，细胞凋亡明显增多(P<0.01)，caspase-3活性显著增高(P<0.01)，同时伴随着胞浆内ROS生成增多和脂质氧化水平增高(P<0.01)。与H/R组相比，H/R+Nox4-siRNA组Nox4蛋白水平显著降低(P<0.01)，细胞生存率进一步降低(P<0.05)，细胞凋亡进一步增多(P<0.01)，caspase-3活性进一步增高(P<0.01)，同时伴随着胞浆内ROS生成和脂质氧化水平的进一步增高。2.与control组相比，H/R组H9C2心肌细胞线粒体ROS生成明显增加(P<0.01)，线粒体膜电位和ATP水平显著降低(P<0.01)，NAD+/NADH比值明显增加(P<0.01)，Sirt3表达量明显降低(P<0.01)。与H/R组相比，H/R+Nox4-siRNA组线粒体ROS生成进一步增加(P<0.01)，线粒体膜电位和ATP水平进一步缺失(P<0.05)，NAD+/NADH比值明显降低(P<0.01)，而Sirt3蛋白水平进一步降低(P<0.05)。结论下调Nox4的表达显著加重H/R诱导的心肌细胞损伤、增加胞浆内ROS的生成以及脂质过氧化反应，这些结果提示内源性Nox4在H/R损伤中发挥着心肌细胞保护作用。内源性Nox4发挥心肌保护作用的机制可能是通过上调NAD+/NADH比值，增加Sirt3的表达，减轻线粒体氧化损伤和能量合成障碍来实现的。这些研究结果为深入认识Nox4的心脏保护效应提供了新的实验依据，为临床防治MI/R损伤提供了新的研究方向。