论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种主要感染2周龄内小猪的高度接触性肠道传染病,患病仔猪常见严重腹泻、呕吐和脱水症状,其致死率可达100%。TGEV是引起大规模化养殖场仔猪腹泻性死亡的重要原因,近几年来对世界猪业的健康发展造成了严重损失。由于TGEV致病的机制尚未完全探明,所以此病的防治仍旧困难。肠道腹泻主要与小肠上皮细胞刷状缘膜内Na~+/H~+交换蛋白NHE3的功能有关。且猪传染性胃肠炎病毒主要经消化道感染小肠,TGEV在小肠上皮细胞内大量复制,此时会破坏上皮细胞钠离子转运功能,导致肠道渗透压升高,引起腹泻。课题组前期研究表明,TGEV感染小肠上皮细胞(IPEC-J2)能降低细胞表面NHE3的表达并降低NHE3的活性,减少小肠上皮细胞对胞外Na~+的吸收。结果表明TGEV致腹泻机理中NHE3可能具有重要作用。但在仔猪真实体内环境中结果是否一样,仍待进一步确定。在正常生理情况下NHE3在细胞质膜和胞内核内体之间循环,最终转运至质膜顶端,发挥其生物活性,但TGEV感染IPEC-J2细胞后是如何调控NHE3的循环运转,目前尚未探明。因此,本实验先以IPEC-J2细胞为感染模型,通过分析TGEV感染组与未感染组蛋白组学数据,对差异表达蛋白进行分析,筛选调控NHE3活性的信号分子。在精密肠组织切片(Precision-cut intestinal slices,PCIS)和IPEC-J2细胞上验证TGEV感染后NHE3活性的影响。再通过检测网格蛋白Clathrin表达量变化验证TGEV感染是否通过网格蛋白调控NHE3活性。主要研究内容如下:1.TGEV感染IPEC-J2细胞蛋白组学研究为了解TGEV感染后对IPEC-J2细胞蛋白表达的影响,通过非标定量技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术对感染TGEV与未感染的IPEC-J2细胞样本进行定量蛋白组的研究。共鉴定到5143个蛋白质,其中有3936个蛋白质包含定量信息。在定量到的蛋白质中,TGEV vs NC比较组中559个蛋白表达发生上调,473个蛋白表达发生下调。基于上述数据,我们对所有鉴定到的蛋白质进行系统性的生物信息学分析(包含蛋白功能注释),并且对所有的差异表达蛋白进行功能分类、功能富集和基于功能富集的聚类分析。结果显示TGEV感染后能下调NHE3的表达,并且有关膜运转与内吞的蛋白通路有差异表达,综合以上信息,我们推测TGEV感染可通过诱导宿主细胞信号分子参与调控NHE3活性。2.TGEV感染后NHE3表达量的检测采取健康1周龄仔猪小肠,用冰冷KHB缓冲液清洗后填充3%低熔点琼脂糖,置于冰冷KHB缓冲液中,待其凝固再次用低熔点琼脂糖包被,修剪组织块,转至无菌组织切片机中切割制备小肠精密切片。挑取切片于WME培养基培养。采用ATP检测试剂盒与活死细胞染色试剂检测切片活性,HE染色检测切片组织完整性。采用RT-PCR验证病毒感染,利用冰冻切片免疫荧光验证小肠组织NHE3的表达量。再用TGEV感染IPEC-J2细胞,利用免疫荧光检测细胞膜表面NHE3蛋白表达量,利用qRT-PCR检测NHE3 mRNA转录水平。结果显示,TGEV能成功感染PCIS,小肠切片在24h时活性下降至一半,且随着感染时间的增加,小肠完整性逐渐降低,小肠绒毛在24h后几乎脱落,TGEV感染后小肠组织上NHE3的表达量下降。在IPEC-J2细胞上,TGEV感染能降低膜表面NHE3的表达与NHE3的转录水平。3.TGEV感染IPEC-J2细胞后对Clathrin和NHE3内吞的影响首先利用绝对荧光定量检测TGEV在IPEC-J2上的生长动力学,生物素化法检测内吞囊泡中NHE3的蛋白表达量变化;利用蛋白免疫印迹Western-blot检测磷酸化Ezrin和Clathrin表达量,应用相对荧光定量方法检测Clathrin的相对mRNA水平。结果发现:病毒生长曲线测定表明TGEV mRNA的最佳检测时间为感染后12h,TGEV感染后能导致内吞囊泡中NHE3蛋白表达量增高,也能使磷酸化Ezrin表达量升高,Clathrin蛋白表达量和mRNA转录水平降低。