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羽衣甘蓝(Brassica Oleracea var acephala)为十字花科芸墓属二年生草本植物,是食用甘蓝的一个园艺变种。因叶片颜色绚丽,营养价值极高而被广泛种植,并应用于园林园艺。野生型羽衣甘蓝的花由四枚萼片、呈十字排列的四枚花瓣、六枚雄蕊、一枚雌蕊构成。但是,能够稳定遗传的花瓣数目异常突变体表现为花瓣数目减少或增多的特性,其中花瓣缺少突变体的花瓣数为零枚到三枚不等,花瓣增多突变体的花瓣数量为五枚到多枚并可分内外多轮不等。本研究以解析羽衣甘蓝花发育的分子调控网络及突变体形成原因为目标,主要侧重于羽衣甘蓝中MADS-box基因BoaAG(C类)、BoaSEP1、BoaSEP2、BoaSEP3(E类)、BoaAGL6(与E类基因为姊妹系)的功能关系、时空表达模式的分析,分析羽衣甘蓝花瓣数目异常突变体调控花瓣形成分子机制,完善和发展花发育的分子机理打下坚实的基础。(1)羽衣甘蓝MADS-box基因的全长cDNA克隆应用RACE等技术克隆羽衣甘蓝花器官发育过程中所表达的BoaAG、BoaSEP1、BoaSEP2、BoaSEP3、BoaAGL6基因的cDNA序列全长,分别得到全长为1163bp的BoaAG(登录号:KC984300,编码255个氨基酸)、全长为1114bp的BoaSEP1(登录号:KC967957,编码250个氨基酸)、全长为1443bp的BoaSEP2(登录号:KC967958,编码211个氨基酸)、全长为996bp的BoaSEP3(登录号:KC967960,编码250个氨基酸)、全长为999bp的BoaAGL6(登录号:KC984301,编码252个氨基酸)共五个基因。(2)羽衣甘蓝MADS-box基因的系统进化分析分别构建系统进化树,确定BoaAG属于euAG、BoaSEP1、BoaSEP2属于LOFSEP进化系、BoaSEP3属于SEP3进化系、BoaAGL6属于euAGL6进化系。并对5个蛋白的一级结构和二级结构以及作用区域进行预测,发现均为疏水性碱性蛋白。(3)运用半定量PCR与Real-time PCR分析羽衣甘蓝花器官发育相关的时空表达差异分析了花器官发育相关基因BoaAG、BoaSEP1、BoaSEP2、BoaSEP3、BoaAGL6在花发育过程中特异的时空表达方式以及表达区域,发现在羽衣甘蓝突变体中,BoaAG基因基本不表达,初步验证其在花瓣数量变化中基本不起作用;而属于E类基因及其姊妹系的BoaSEP1/2/3和BoaAGL6在多瓣突变体花瓣中的表达量有所升高,说明其在突变体发育过程中可能起到十分关键的作用。(4)构建羽衣甘蓝MADS-box基因过表达载体,进行功能验证本研究构建了 pUN1301-BoaAG、pUN1301-BoaAGL6两个重组质粒,转入根癌农杆菌中,通过蘸花法转化拟南芥。通过观察突变体表型来验证两种MADS-box基因的功能关系。目前已获得了转基因拟南芥植株的F2种子。