【摘 要】
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Argonaute(AGO)蛋白是一类高度保守的碱性蛋白家族,主要包括4个结构域,分别是N端、PAZ、Middle和PIWI。其中PIWI具有RNaseH酶的活性,可以与siRNA(smallinterferingRNA)结合切割m
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Argonaute(AGO)蛋白是一类高度保守的碱性蛋白家族,主要包括4个结构域,分别是N端、PAZ、Middle和PIWI。其中PIWI具有RNaseH酶的活性,可以与siRNA(smallinterferingRNA)结合切割mRNA,PAZ可以非特异性的识别结合双链小RNA3’端悬垂的两个核苷酸,因此AGO蛋白参与到smallRNA(如miRNA、siRNA)的基因调控之中,AGO蛋白主要以RNA诱导沉默复合体(RISC)的形式来发挥功能。AGO蛋白功能的研究将更加有利用于揭示生物体内的基因调控机制,从而为人类疾病治疗和生物遗传发育的研究提供更加有利的条件。
家蚕作为人类最早驯化的动物之一,具有重要的经济价值。同时作为鳞翅目的模式生物,在研究昆虫的变态发育及农林业害虫防治中也发挥着重要的作用。目前,在家蚕发现的AGO蛋白有4种,分别是AGO1、AGO2、AGO3和PIWI,其功能目前研究的还不是很清楚。在本研究中以家蚕细胞BmN为研究对象,通过构建RNAi干扰载体,试图探究蛋白AGO1和AGO2在家蚕细胞中的功能,为进一步研究smallRNA和靶标基因之间的作用机制提供初步基础。
RNAi载体的构建主要是根据基因沉默的原理,RNAi载体在家蚕细胞中转录成特定的发卡结构hairpinRNA,在Dicer酶的作用下,切割成siRNA,干扰AGO1和AGO2的表达。实验中用到的载体是pBac[A3-EGFPafm]和辅助质粒phsp,辅助质粒可以在细胞内表达转座酶,将构建成功的RNAi载体和辅助质粒共转染到家蚕细胞BmN中,在辅助质粒的作用下,可以将干扰片段整合到基因组上,稳定表达。
利用脂质体转染的方法,将构建好的载体和辅助质粒共转染到家蚕细胞中,转染48h后开始观察细胞,直到96h后观察到绿色荧光,连续观察并记录细胞形态变化,7天后收集细胞并提取总RNA,利用real-time荧光定量PCR鉴定AGO1和AGO2基因表达的变化,本研究中以家蚕Actin-3为内参,结果显示AGO1和AGO2的基因表达量明显降低。通过记录细胞形态,发现有绿色荧光的细胞比周围的细胞有变大、变圆的趋势,这为后续对不同AGO基因进行干涉或过表达研究家蚕中小RNA表达水平的变化提供了很好的平台。
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