白血病是一类发生在造血系统,严重危害人类健康的恶性克隆性疾病,也是儿童及青少年发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近年来,虽然越来越多的学者致力于白血病的病因和发病分子机制的研究,但由于致病机制比较复杂,目前尚不完全明确。随着对白血病发病机制的深入研究,人们发现Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活在骨髓正常或异常造血过程中起着关键作用,与白血病的发生发展和不良预后有密切关系。该信号通路主要由Wnt、FZD膜受体家族成员、Dsh、β-catenin、APC、Axin、GSK3β及细胞核内LEF/TCF家族及下游靶基因组成,能够介导细胞-细胞黏附作用以及转录基因的表达,在调节细胞的凋亡、增殖、分化、移行等过程中起着重要的作用。其中β-catenin是Wnt/β-catenin信号转导通路中的核心分子,是一种多功能的蛋白质。Wnt/β-catenin信号转导通路的激活能够引起细胞质内的β-catenin核移位,从而激活细胞核内的LEF/TCF转录因子及其下游靶基因的转录表达。大量研究表明β-catenin蛋白在多种急性白血病细胞系中高表达,与白血病的不良预后有密切关系,然而β-catenin在白血病发生发展中的致病机理和分子机制目前尚不完全清楚。APC是Wnt/β-catenin信号转导通路的重要负调节因子,APC蛋白的缺失易导致β-catenin在细胞核内聚集,最终引起Wnt/β-catenin信号通路的激活。有研究发现,APC基因敲除小鼠和β-catenin转基因小鼠均能够引起粒-单核系祖细胞(GMPs)及髓细胞的衰减或耗竭,而不影响巨核细胞-红细胞前体细胞(Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors,MEPs),髓细胞系细胞数量的减少与造血干细胞的耗竭有关,但与髓系造血祖细胞的分化抑制是否有关,Wnt/β-catenin能否影响髓细胞白血病细胞的分化功能及其作用机制目前尚不明确。因此,本研究主要以PUER细胞、小鼠骨髓造血干细胞、人急性髓细胞白血病U937为研究对象,研究β-catenin过表达或APC基因敲除对三种细胞单核/巨噬细胞分化的影响及相关分子机制。本课题研究工作主要分为以下三个部分:第一部分β-catenin过表达对PUER细胞和小鼠骨髓间充质干细胞分化功能的影响PUER细胞是体外研究单核/巨噬细胞的理想模型,在4-OHT诱导下,条件性表达PU.1基因及单核/巨噬细胞方向分化。本研究首先以PUER细胞为研究对象,研究β-catenin过表达或敲除APC对其分化功能的影响。将PUER细胞分别稳定转染表达β-catenin或采用RNA干扰技术敲除APC后,采用Western Blot对细胞中β-catenin的表达情况和APC的敲除情况进行分析,构建了能够稳定表达β-catenin的PUER细胞株和APC RNA干扰的PUER细胞株。4-OHT诱导细胞分化后进一步利用流式细胞标记技术、Cytospin细胞甩片涂片和May-Grünwald Giemsa染色技术对PUER细胞的分化情况进行分析。结果表明,高表达β-catenin或敲除APC基因能抑制PUER细胞向单核/巨噬细胞分化。为进一步证实β-catenin过表达对造血干细胞分化功能的影响,本研究体外分离C57BL/6小鼠骨髓造血干细胞,并使β-catenin在该细胞中高表达,研究β-catenin高表达对GM-CSF诱导的小鼠骨髓造血干细胞分化的影响。结果显示,β-catenin高表达能够抑制GM-CSF诱导的小鼠骨髓造血干细胞向单核/巨噬细胞方向分化。第二部分β-catenin过表达对人单核巨噬细胞性白血病细胞U937分化功能的影响本部分主要研究β-catenin在人白血病细胞中高表达后,能否进一步影响白血病细胞的分化功能。课题研究中首先构建β-catenin表达质粒,稳定转染U937细胞使β-catenin在白血病细胞中高表达(Western Blot验证证实),然后加入50ng·m L-1PMA诱导U937细胞分化,选取CD14、CD11b和CSF1R作为PMA诱导U937分化后的表面标志物,用流式细胞染色分析技术和RT-PCR分别分析表面标志物的表达水平。结果显示,β-catenin高表达能抑制U937细胞CD14、CD11b和CSF1R的表达水平。May-Grünwald Giemsa染色结果显示,与对照相比,β-catenin过表达的U937细胞分化为单核/巨噬细胞的形态学改变不明显,说明β-catenin高表达能抑制U937细胞向单核/巨噬细胞方向分化。本研究进一步采用基因干扰技术敲除APC基因(APC sh RNA#1和#2),采用Western Blot测定β-catenin的表达情况及APC基因敲除对U937分化功能的影响。结果显示,U937细胞敲除APC基因后β-catenin表达增加,且CD14和CD11b的表达水平较对照组下降,说明APC基因敲除能够上调下游β-catenin的表达水平,进而抑制U937细胞向单核/巨噬细胞方向分化。第三部分β-catenin对单核/巨噬细胞分化功能影响的机制研究为研究β-catenin拮抗PU.1基因,抑制单核/巨噬细胞分化的机制,本部分首先将β-catenin在PUER细胞内过表达后,研究PUER分化前后(PU.1基因未诱导表达及诱导表达24h)全基因表达谱的变化,利用cluster 3.0聚类分析和signification analysis of microarray(SAM)R程序等方法研究差异基因的表达,从中筛选出与单核/巨噬细胞分化相关的重要差异表达蛋白进行进一步研究。本研究发现PU.1基因表达过程中,上调的基因有505个,下调的基因有390个。其中505个基因中有219个基因的表达是能够被β-catenin抑制的,390个下调的基因中有72个是能够被β-catenin又上调的。在这些差异表达基因中,Egr2是一种重要的转录因子,与单核巨噬细胞分化有关,在单核巨噬细胞分化过程中表达水平明显增高。本研究采用RT-PCR的方法发现β-catenin过表达能够显著抑制Egr2的表达,抑制单核巨噬细胞的分化;而Egr2高表达后又促进PUER细胞或U937细胞向单核巨噬细胞分化,该结果在PUER细胞以及白血病细胞U937中均得到验证,表明Egr2能够抑制β-catenin的表达,在促进单核巨噬细胞分化中起着非常重要的作用。进一步采用染色质免疫共沉淀(Ch IP)法和荧光素酶报告基因系统验证?-catenin与Egr2启动子区转录结合位点及结合活性。Ch IP结果显示,β-catenin和TCF4复合物均在Egr2启动子区存在结合位点,荧光素酶报告基因检测结果显示,随着转染质粒β-catenin的增加,荧光素酶荧光强度显著降低。上述两个结果表明β-catenin能够抑制Egr2启动子活性。综上,在PUER及U937细胞中证明β-catenin能够通过抑制PU.1靶基因Egr2的表达,抑制造血细胞单核/巨噬细胞方向的分化潜能,Egr2过表达能够逆转β-catenin引起的分化抑制。本研究为白血病的发生发展提供新的分子机制,进而为白血病的诊断和治疗提供新的靶点,也为研究外源化合物引起血液系统恶性病变的致病机理奠定一定的理论基础。